Development of flow cytometry-based techniques for assessing microbial inactivation after water disinfection and downstream processes

Abstract

Overvåking av mikrobiell vitalitet i akvatiske miljøer kan være utfordrende. Flere metoder er tilgjengelig, og Flow cytometri (FCM) analyser er en effektiv måte å få informasjon om mikrobene. Å kombinere ulike liv/død-farginger med FCM analyser gjør det mulig å dele inn i populasjoner av levende celler med aktivitet, skadede celler, eller døde celler. Anvendelse av FCM til overvåking av mikrobiell vannkvalitet innen ballastvann transport og akvakultur, kan løse noen av begrensningene i eksisterende metoder som PCR og kultivering. Transport av ballastvann kan forårsake spredning av invaderende arter i ulike geografiske områder. Internasjonale regelverk krever at ballastvann skal renses før utslipp for å sørge for inaktivering og/eller fjerning av mikrober. Tilsvarende problemer finnes også i akvakulturnæringen, hvor brønnbåter utgjør en risiko for spredning av sykdommer mellom anlegg. Effektivitet av behandling og effekt på celler i de ulike vannbehandlingene krever både dokumentasjon og overvåking. Denne avhandlingen beskriver og diskuterer dobbeltfarging kombinert med FCM som metodikk for å evaluere vitalitet hos fytoplankton og bakterier før og etter UV- og varmebehandling. Den første dobbeltfargingen jeg undersøkte kombinerer CFDA-AM, som utrykker esterase aktivitet, med SYTOX Blue for membranpermeabilitet til å undersøke vitalitet hos Tetraselmis suecica (Publikasjon I). Reparasjon og gjenvekst av T. suecica celler etter behandling med UV doser mellom 100 og 400 mJ/cm2 ble evaluert etter inkubasjon i lys og mørke. Både esterase aktivitet og membranpermeabilitet ble påvirket av høye UV doser på 300 og 400 mJ/cm2, og økningen i celleskader ved inkubasjon i lys var høyere enn ved mørkeinkubasjon. Dobbeltfargingen skilte effektivt mellom levende, skadede og døde celler i alle prøvene. Metoden er egnet til å bestemme vitalitet hos fytoplankton etter behandling i UV-baserte ballastvann behandlingssystemer. Den andre dobbeltfargingen består av Bioorthogonal non-canonical aminosyre tagging (BONCAT), som gjør det mulig å følge proteinsyntesen hos bakterier, sammen med DNA-farging (Publikasjon II). I BONCAT-metodikken blir celler inkubert med en analog aminosyre, før en klikk-reaksjon med et fluoriserende molekyl gjør det mulig å identifisere cellene med aktiv proteinsyntese. Metoden ble tilpasset til FCM ved å justere konsentrasjonen av den analoge aminosyren, teste ulike klikk-fargestoffer, og kombinere med ulike DNA fargestoffer i Escherichia coli. Bruken av FCM reduserte analysetiden sammenlignet med mikroskopi. Anvendelse av metoden for naturlige prokaryote samfunn viste at kun en liten populasjon av cellene i prøvene var aktive. Publikasjon III beskriver undersøkelser av bakteriell vitalitet ved å kombinere BONCAT/SYBR Green farging med FCM analyser av UV- og varmebehandlede vannprøver. E. coli og naturlige bakteriesamfunn ble behandlet med UV-doser mellom 25 og 200 mJ/cm2. I tillegg ble varmebehandling (fra 15 til 45 min ved 55 ºC) brukt for å observere effekter på proteinsyntesen. Kimtall, samt farging med Propidium Iodine (PI) og SYTO9 etterfulgt av FCM analyser, ble brukt for å sammenlikne resultatene fra BONCAT vitalitets-analysene. Både UV- og varmebehandlingene påvirket proteinsyntesen og DNA integriteten i cellene for både monokultur og naturlige bakteriesamfunn. Proteinsyntesen var fremdeles aktiv 24 og 48 timer etter behandling for hhv E. coli og naturlige bakteriesamfunn. CFDA-AM/SYTOX Blue og BONCAT/SYBR Green er spesifikke fargemetoder som avdekker viktige cellefunksjoner som er direkte koblet til celle vitalitet. De to dobbeltfargingene for fytoplankton og bakterier har vist seg å være kompatible med FCM analyser. Bruk av FCM i vannkvalitetsanalyser bør vurderes for både akvakulturnæringen og ballastvann overvåking.

Monitoring aquatic microbial vitality is challenging. Several methods are available, and flow cytometry analysis (FCM) and vitality stains represent an advantageous way to obtain information on microbes. When combining vitality stains with FCM, single cells can be classified into live cells with activity, damaged cells, or dead cells. Applications of FCM to microbial water quality monitoring in ballast water transport and aquaculture may solve limitations from current methods like PCR and cultivation. Ballast water transport can cause the spread of invasive species in different geographical areas. International regulations require water treatment prior to release to ensure microbial inactivation and/or removal. Well-boats used in the aquaculture industry represent a similar problem by potentially spreading diseases between farms. The efficiency of treatments and effect on cells of various water treatments need documentation and monitoring. In this thesis, two double staining methods combined with FCM were applied to understand and evaluate phytoplankton and bacterial vitality before and after UV and heat treatments. Firstly, the combination of esterase substrate CFDA-AM and membrane permeability stain SYTOX Blue was used to follow Tetraselmis suecica vitality for ballast water UV-based treatment system (BWTS) (Paper I). Recovery and regrowth of T. suecica cells after treatment with UV doses between 100 and 400 mJ/cm2 was evaluated after incubation in light and dark. Esterase activity and membrane permeability were affected by high UV doses of 300 and 400 mJ/cm2. Subsequently, incubation in the light increased the cell damages compared to incubation in the dark. The double staining was efficient to detect live, damaged, and dying cells in all samples. The method is effective to determine vitality of phytoplankton for BWTS. Secondly, Bioorthogonal non-canonical amino acid tagging (BONCAT) was used to monitor protein synthesis in bacteria (Paper II). The procedure consists in an incubation of bacteria with an analogous amino acid followed by a click reaction. The click method links a fluorescent molecule to the analogous amino acid, thus making newly synthesized proteins detectable. The method was adapted to FCM by calibrating the analogous amino acid concentration, testing of different click dyes, and combination with DNA stains using Escherichia coli as a test organism. Implementation of flow cytometry for analysis decreased analysis time compared to microscopy. Application to natural prokaryote communities revealed that only a small population of the sampled organisms were active cells. Lastly, the determination of bacterial vitality after UV and heat treatment with BONCAT/SYBR Green staining and FCM analysis was explored in Paper III. E. coli and natural bacterial communities were treated with UV doses between 25 and 200 mJ/cm2. In addition, heat treatments (from 15 to 45 min at 55 ºC) was tested to observe effects on protein synthesis. Other methods such as plate counts and membrane permeabilization stains Propidium Iodine (PI) and SYTO9 were used to compare vitality levels with BONCAT/SYBR Green staining. Both treatments affected protein synthesis and DNA integrity for monoculture and natural bacterial communities. Protein synthesis activity still remained at 24h (for E. coli) and 48h (for natural communities) after treatments. CFDA-AM/SYTOX Blue and BONCAT/SYBR Green are specific vitality stains covering important cell parameters directly linked to cell vitality. Both double staining methods for phytoplankton and bacteria have proven to be compatible for FCM analysis. Application of FCM to water microbial quality analysis can be considered for aquaculture industry and ballast water monitoring.