The use of 16S rRNA targeted next generation sequencing in diagnostics of polymicrobial invasive infections

Abstract

16S rRNA dypsekvensering muliggjør, som vist i flere vitenskapelige arbeider, en mer fullstendig karakterisering av komplekse bakterielle mikrobiota enn det som kan oppnås ved tradisjonelle, dyrkningsbaserte, mikrobiologiske teknikker. De vitenskapelige arbeidene indikerer også at 16S rRNA dypsekvensering kan være nyttig i kliniske mikrobiologisk diagnostikk, men så langt har få studier undersøkt egnetheten til denne metoden i diagnostikk av pasienter med polymikrobielle infeksjoner.

Hovedmålet med denne oppgaven var å undersøke bruken av 16S rRNA dypsekvensering i mikrobiologisk diagnostikk av polymikrobielle, invasive infeksjoner. Som en del av dette arbeidet ønsket vi også å evaluere effekten av supplerende dypsekvensering av rpoB-genet for å oppnå bedre oppløsning på artsnivå, utforske mønstrene ved DNA-kontaminasjon og foreslå transparente metoder for håndtering av DNA-kontaminasjon og tolkning av dypsekvensseringsdata i en diagnostisk setting.

Resultatene våre bekrefter den forbedrede sensitiviteten til 16S rRNA dypsekvensering sammenlignet med tradisjonell diagnostikk av polymikrobielle invasive infeksjoner. Vi demonstrerer også nytten av rpoB-gen dypsekvensering, som gir en mer presis artsidentifikasjon innen flere klinisk viktige bakterieslekter. Vi utforsker og beskriver den uforutsigbare naturen til DNA-kontaminasjon, og foreslår og evaluerer en metode for å håndtere denne kontaminasjonen og dermed bedre nøyaktigheten av dypsekvenseringsresultatene. Arbeidet gir også ny innsikt i patogenesen til polymikrobielle infeksjoner.

Resultatene våre viser at iboende metodiske utfordringer ved 16S rRNA dypsekvensering kan overvinnes, og at dypsekvensering kan være nyttig ved diagnostikk av polymikrobielle infeksjoner hos den enkelte pasienten.

As made evident from scientific investigations, 16S rRNA targeted next generation sequencing (TNGS) enables a more complete characterization of complex bacterial microbiotas than what can be obtained by standard culture-based microbiological techniques. Such data suggest that TNGS could be of use in the clinical laboratory as well, but so far, few studies have explored the adequacy of this method in the diagnostics of patients suffering from polymicrobial infections.

The main objective of this thesis was to investigate the use of 16S rRNA TNGS in microbiological diagnostics of polymicrobial invasive infections. As part of this endavour, we also wanted to evaluate the effect of supplementary rpoB gene TNGS on species-level resolution, explore the patterns of background contamination and suggest transparent approaches for management of DNA-contamination in postsequencing processing and interpretation in a diagnostic setting.

Our results confirm the improved sensitivity of 16S rRNA TNGS as compared to traditional diagnostics for polymicrobial invasive infections. We also demonstrate the utility of rpoB sequencing, which provides more accurate species identifications for several clinically important genera. Upon exploring the unpredictable nature of background contamination in TNGS, we suggest and evaluate a method for managing the contamination, including rules and cutoffs for post-sequencing processing and interpretation to maximize accuracy of the results. The data also provide new insights into the pathogenesis of polymicrobial infections.

Our results thus demonstrate that methodological challenges inherent to TNGS can be overcome, and that TNGS may be useful for diagnostics of polymicrobial infections in individual patients.