Immune regulatory mechanisms in endocrine autoimmune disorders

Abstract

Ulike mekanismer eksisterer for at immunforsvaret skal lære å skille det som er eget fra det som er fremmed, også kjent som immunologisk toleranse. I noen tilfeller brytes denne toleransen, noe som kan føre til at enkelte utvikler autoimmune sykdommer. Det som er interessant er at pasienter med immunsvikt også ofte utvikler autoimmunitet. Dette kan tyde på at en feil i immunforsvarets regulerende mekanismer kan være en felles risikofaktor. Regulatoriske T celler (Tregs) har evnen til å dempe en immunrespons og er veldig viktige for å opprettholde toleranse. Et annet fellestrekk er sirkulerende autoantistoffer rettet mot cytokiner, som er funnet i både immunsvikt og autoimmunitet, men hvordan disse mekanismene virker sammen for å regulere toleranse er fortsatt uvisst. I denne avhandlingen har ulike metoder blitt brukt for å studere regulatoriske mekanismer i to modellsykdommer for autoimmunitet.

I artikkel I undersøkte vi transkriptomet og proteomet til in vitro ekspanderte Tregs fra pasienter med den monogene sykdommen autoimmunt polyendokrint syndrom type 1 (APS-1). Vi brukte enkelt-celle og T celle reseptor (TCR) sekvensering for å se på forskjell i genuttrykk mellom pasienter og kontroller. Samlet viste resultatene få forskjeller i transkriptomet til ekspanderte Tregs og TCR repertoar mellom pasienter og kontroller. Analyse med flow- og massecytometri viste at CD4+CD25+FOXP3+CD127- populasjonen var signifikant redusert hos APS-1 pasienter sammenlignet med friske kontroller. For å undersøke Tregs sin evne til å dempe proliferering av responder celler, satte vi opp et flowcytometri-basert suppresjonsassay, som viste at ekspanderte Tregs fra APS-1 pasienter kan hemme celledeling like bra som ekspanderte Tregs isolert fra friske kontroller.

I artikkel II ville vi undersøke frekvensen av Tregs i PBMC og den suppressive kapasiteten til ekspanderte Tregs i pasienter med den endokrine autoimmune sykdommen primær binyrebarksvikt, med polygent arvemønster. I tillegg har vi sett på forskjeller mellom Tregs fra disse pasientene og friske kontroller på transkripsjonsnivå og studert mitokondriell respirasjon. Ingen forskjeller ble funnet i frekvensen av Tregs i PBMC når pasienter og kontroller ble sammenlignet. Suppresjonsassayet viste at det ikke er forskjeller mellom pasienter med primær binyrebarksvikt og friske kontroller når det kommer til å dempe proliferering av responder celler. Vi gikk videre med RNA-sekvensering for å se om vi kunne finne forskjeller på gennivå. Igjen viste resultatene få forskjeller mellom pasienter og kontroller, men flere gener uttrykt i mitokondriene var oppregulert i pasientgruppen. For å studere mitokondriell funksjon, satte vi opp et Seahorse metabolisme assay for å måle raten av oksygenforbruk. Assayet viste at Tregs fra pasienter hadde en basal-, maksimal-, og ikke-mitokondriell respirasjon, i tillegg til proton lekkasje og reservekapasitet på nivå med målinger for friske kontroller.

I artikkel III ønsket vi å finne ut om cytokin-autoantistoff-screening kan brukes til å identifisere pasienter med mono- eller oligogen årsak til sykdom. Et enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ble satt opp for å måle autoantistoffer mot interleukin (IL) 22, mens et etablert radioaktivitetsassay ble brukt til å mål autoantistoffer mot interferon (IFN)-ω. Positive pasienter ble deretter sekvensert med et panel bestående av immunerelaterte gener etter standard protokoll fra Medisinsk avdeling, Haukeland Universitetssykehus. Med denne strategien identifiserte vi fire nye pasienter med APS-1 og to pasienter med sykdomsfremkallende mutasjoner i henholdsvis NFKB2 og CTLA4. I tillegg fant vi sjeldne varianter i IKZF2, LAT, LCK, STAT1, JAK3, RAG1, TERC, TNFAIP3 og en variant av AIRE som er assosiert med primær binyrebarksvikt, varianter som kan være forårsakende for de kliniske manifestasjonene hos pasientene.

Resultatene fra denne avhandlingen bidrar med økt kunnskap om regulatoriske mekanismer involvert i immunologisk toleranse og viser at screening for autoantistoffer er et verdifullt diagnostisk verktøy. Videre åpner funnene for studier som karakteriserer monogene sykdommer med autoantistoffer mot cytokiner og andre regulatoriske mekanismer.

The immune system is, through various regulatory mechanisms, taught to discriminate self from non-self, known as immunological tolerance. Sometimes breakdown of tolerance occur, leading to autoimmune disease in susceptible individuals. Of note, patients with immunodeficiencies also commonly present with autoimmune components, indicating that impaired regulatory mechanisms might be a shared risk factor. Cells with suppressive function, particularly regulatory T cells (Tregs), are crucial for regulation of tolerance and alterations in the Treg compartment can contribute to disease development. Another shared factor is circulating autoantibodies targeting cytokines, which have been described in both immunodeficiency and autoimmunity. However, details on how these mechanisms come together and regulate immune tolerance still remain elusive. In the present work, several approaches have been used to study immune regulatory mechanisms in human model disorders of autoimmunity.

In paper I, we aimed at investigating the proteome and transcriptome of in vitro expanded Tregs from patients with the monogenic autoimmune polyendocrine syndrome type 1 (APS-1). Single-cell and T cell receptor (TCR) sequencing was performed to examine differential gene expression and analyze the TCR repertoire. Overall, the expanded Treg transcriptome and TCR repertoire were found to be similar between patients and controls. Multipanel flow and mass cytometry revealed a significantly reduced CD4+CD25+FOXP3+CD127- population in patients compared to healthy donors. An optimized flow cytometry based Treg suppression assay revealed that APS-1 expanded Tregs could suppress responder cell proliferation to the same degree as expanded Tregs from healthy controls.

In paper II, we wanted to examine the frequency of Tregs in PBMC and explore in vitro expanded Treg suppressive function, transcriptome and mitochondrial function in autoimmune primary adrenal insufficiency (PAI), an endocrine autoimmune disorder with a polygenic inheritance pattern. No differences were observed in the frequency of Tregs in PBMC when comparing patients and healthy controls. The Treg suppression assay showed that expanded PAI Tregs were able to suppress proliferation of responder cells similar to expanded healthy control Tregs. However, the RNA sequencing revealed an upregulation of mitochondrial genes in the patient group. To further examine mitochondrial function, a Seahorse mitochondria stress test assay was performed. Patient cells displayed a basal, maximal and non-mitochondrial respiration, in addition to proton leak and spare capacity, comparable to that of healthy controls.

In paper III, we wanted to examine whether screening of patients with known endocrine disorders for cytokine autoantibodies could identify individuals with a possible monogenic or oligogenic cause of disease. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was optimized and performed to screen patients with autoimmune PAI for autoantibodies against interleukin (IL) 22, while an established radio-immuno assay (RIA) was used to screen patients with a variety of endocrine autoimmune disorders for autoantibodies against interferon (IFN)-ω. Positive patients were subsequently sequenced with an immune deficiency pipeline at Haukeland University Hospital. This strategy identified four new patients with APS-1 and two patients with disease-causing mutations in NFKB2 and CTLA4, respectively. Further, rare variants were detected in the genes IKZF2, LAT, LCK, STAT1, JAK3, RAG1, TERC, TNFAIP3 and one variant of AIRE associated with autoimmune PAI, all with potential roles as causative factors for the clinical manifestations seen in these patients.

Together, the findings from this thesis furthers our knowledge on immune regulatory mechanisms in autoimmune disease and highlights the use of autoantibody screenings as a part of the diagnostic toolbox. Our findings open for future studies involving further characterization of monogenic diseases with cytokine autoantibodies and of immune regulatory mechanisms.