Development of chemogenetic tools from invertebrate ion channels

Abstract

Reseptorer som er konstruert for heterolog ekspressjon og aktivitet kun som respons på spesifikke eksogene ligander er kjent som kjemogenetiske verktøy og brukes til å studere hjernefunksjon ved å nøyaktig modulere elektrisk aktivitet i nevrale populasjoner. Uspesifikk aktivitet av eksogene ligander på endogene pattedyrsreseptorer og sensitiviteten til den konstruerte reseptoren utgjør en betydelig utfordring for sikkerheten og effekten av de nåværende verktøyene. I mine studier, vil jeg karakterisere FMRFamide (FMRFa)-gatede natriumkanaler (FaNaCs) fra spiralian dyr (f.eks. ormer og bløtdyr), etablere det molekylære grunnlaget for deres aktivering av nevropeptider, og deretter konstruere dem til kjemogenetiske reseptorer med høy ligand sensitivitet og spesifisitet. Denne avhandlingen beskriver resultatene. Først, med hjelp av molekylær fylogenetikk og elektrofysiologi, avdekker jeg en bredere FaNaC-familie som inkluderer tallrike bløtdyr og annelidkanaler responsive til nevropeptider FMRFa, FVRIamider, og/eller Wamider (eller myoinhibitoriske peptid-lignende peptider). For det andre, en grundig sammenlignende analyse mellom FaNaCs og den overordnede degenerin (DEG)/epitel natriumkanal (ENaC) superfamilien tillot meg å gjenkjenne bevarte aminosyrerester blant FaNaCs. Mutagenese av disse bevarte aminosyreneog påfølgende elektrofysiologiske analyser av mutanter avslørte bestemmelsene for ligandpotens. I samarbeid med strukturelle biologer, fikk vi høyoppløselige 3D-strukturer av en annelid FaNaC, noe som betydelig forbedret min forståelse av struktur-funksjonsforholdet i FaNaCs. Til slutt, ved bruk av disse funnene, konstruerte jeg mutasjoner i tre bløtdyr FaNaCs og en annelid Wamide-gated natriumkanal (WaNaC), og forbedret deres sensitivitet til respektive nevropeptid ligander med en faktor på opptil 1000. Således beskriver denne avhandlingen ny innsikt i eksiterende reseptorer fra virvelløse dyr og etablerer fire kjemogenetiske reseptorer for videre utvikling til verktøy med redusert risiko for uspesifikkaktivitet, øke sikkerheten og presisjonen av disse verktøyene i kjemogenetiske applikasjoner.

Receptors engineered for heterologous expression and activity only in response to specific exogenous ligands are known as chemogenetic tools and are used to study brain function by precisely modulating electrical activity in neuronal populations. Off-target activity of exogenous ligands on endogenous mammalian receptors and sensitivity of the engineered receptor pose a significant challenge to the safety and efficacy of the current tools. In my studies, I aimed to characterize FMRFamide (FMRFa)-gated sodium channels (FaNaCs) from spiralian animals (e.g. worms and molluscs), establish the molecular basis for their activation by neuropeptides, and subsequently engineer them into candidate chemogenetic receptors with high ligand sensitivity and specificity. This thesis describes the results. First, with the aid of molecular phylogenetics and electrophysiology, I uncover a broader FaNaC family that includes numerous mollusc and annelid channels responsive to neuropeptides FMRFa, FVRIamides, and/or Wamides (or myoinhibitory peptide-like peptides). Secondly, a thorough comparative analysis between FaNaCs and the overarching degenerin (DEG)/epithelial sodium channel (ENaC) superfamily enabled me to recognize conserved amino acid residues amongst FaNaCs. Mutagenesis of these conserved residues and subsequent electrophysiological analyses of the mutants revealed the determinants of ligand potency. Collaborating with structural biologists, we obtained high-resolution 3D structures of an annelid FaNaC, significantly improving my comprehension of the structure-function relationship in FaNaCs. Finally, using these findings, I engineered mutations in three mollusc FaNaCs and an annelid Wamide-gated sodium channel (WaNaC), enhancing their sensitivity to respective neuropeptide ligands by a factor of up to 1000. Thus, this thesis describes new insight into excitatory receptors from invertebrates and establishes four candidate chemogenetic receptors for further development into tools with reduced risk of off-target activity, increasing the safety and precision of these tools in chemogenetic applications.