Application of CRISPR-based gene editing tools in Atlantic salmon

Abstract

Atlantisk laks er den viktigaste arten i norsk havbruksnæring. Næringa i Noreg er i dag ramma av fleire berekraftsufordringar, til dømes genetisk innblanding av rømt laks, og spreiing av smittsame sjukdommar. Dette påverkar både miljøet rundt, og fører til redusert velferd og helse hos fisken. Det er difor eit openbart behov for å beskytte oppdrettsfisken mot smittsame sjukdommar. Ei mogleg løysing på dette kan vere å endre fisken sin genotype ved bruk av genredigering, noko som kan bli gjort ved bruk av CRISPR/Cas genteknologi. Effektiv bruk av denne teknologien krev imidlertid evna til å uføre genredigering med høg nøyaktigheit. I tillegg trenger vi meir artsspesifikk kunnskap om kva gen som kan redigerast. Slik kunnskap kan vi få ved hjelp av CRISPR/Cas-baserte «loss-of-function» og «gain-of-function» eksperiment. Sagt på ein annan måte har CRISPR/Cas verdifulle bruksområde for både fiskeforsking og for havbruksnæringa.

Hovudmålet med denne avhandlinga var å implementere nye CRISPR-baserte verktøy i atlantisk laks. Dette målet er fokuset i Paper I og Paper II, kor vi testa CRISPR/LbCas12a genteknologi og base-redigering. Det sekundære målet var å bruke CRISPR-baserte verktøy til å lage in vivo modellar som kan bidra til å auke forståinga vår rundt biologiske prosessar knytt til laksen sitt immunsystem. Dette målet vart dekka i det siste manuskriptet, Paper III, kor CRISPR/Cas9 vart brukt til å slå ut dei to immungena Immunoglobulin (Ig) M og Interferon gamma (IFNg) i atlantisk laks.

Eksperimenta i denne avhandlinga har blitt utført ved å mikroinjisere fertiliserte lakseegg, etterfølgt av høgkapasitets-sekvensering for å undersøke resultata av genredigeringa. I Paper I vart CRISPR/LbCas12a brukt til å slå ut genet som kodar for pigmentering i laks, solute carrier family 45 member 2 (slc45a2), noko som resulterte i ein albino- eller albinomosaikk-pigmenteringsfenotype. Vi utførte òg eksperiment der donor templat med anten target- eller non-target DNA-tråd-orientering vart inkludert for å vurdere moglegheitene for å setje inn genetisk materiale med LbCas12a nukleasen. Her oppnådde vi opp til 54% integrerings-effektivitet. Til slutt injiserte vi både LbCas12a og SpCas9 CRISPR-kompleks i same individ for å samanlikne dei to nukleasane. Dei to produserte liknande mutasjonseffektivitet, men det var meir perfekt integrasjon av templatet på LbCas12a kuttstaden samanlikna med SpCas9 kuttstaden.

I Paper II brukte vi cytidin base-editoren AncBE4max for å introdusere eit stoppkodon i slc45a2. Vi oppnådde høg konverteringseffektivitet, opp til 89% C-til-T konvertering av den ønska mål-basen. I tillegg vart nokre uønska effektar oppdaga, som insersjonar og delesjonar, bystander-redigering, og konvertering av C-til-ikkje-T, men i liten skala. I Paper II vidareutvikla vi også eit alternativ til base-redigering, enkelt-base utbytting, ved bruk av konvensjonell CRISPR/Cas9. Her inkluderte vi templat med mutasjonar i ulike posisjonar frå kuttstaden. Her såg vi at integrerings-effektiviteten var påverka av mutasjonen sin avstand frå kuttstaden.

I Paper III vart CRISPR/Cas9 brukt til å slå ut IgM hos atlantisk laks, med meir enn 95% mutagenesis på begge IgM loci. Mutagenesis på IFNg mål-staden vart funne til å gjennomsnittleg vere ca. 57%, men med litt usikkerheit rundt dette. Utforskinga av effekten av å slå ut IFNg vart difor utsett i dette arbeidet, men er interessant for framtidige studiar. Effekten av å slå ut IgM på proteinnivå vart undersøkt ved hjelp av flow cytometry. I den genredigerte fisken var det gjennomsnittlege nivået av IgM positive (IgM+) B celler redusert med 91%.

For å konkludere har vi implementert to nye metodar for å utføre genetiske endringar i atlantisk laks, CRISPR/LbCas12 og base-redigering, og har dermed utvida verktøykassen for genredigering i denne arten. I tillegg brukte vi CRISPR/Cas9 til å lage ein F0 atlantisk laks med reduserte IgM+ B celle-nivå, som i framtida kan fungere som ein modell for å auke forståinga vår rundt dette genet, i tillegg til forståinga vår av den atlantiske laksen sitt immunforsvar generelt.

Atlantic salmon is the most important species in the Norwegian aquaculture industry. The industry suffers from several sustainability challenges, such as genetic introgression of escapees and spreading of infectious diseases, which impact the surrounding environment and the welfare and health of the fish. Evidently, there is an overarching need to protect the farmed fish from infectious diseases. Changing the genotype of the fish by gene editing is a viable approach, and one powerful method to achieve this is by using CRISPR/Cas technology. However, effective application of this technology requires the ability to perform the edits with accuracy. Additionally, we need more species-specific knowledge of which genes to edit. Such knowledge can be obtained using CRISPR/Cas-based loss-of-function and gain-of-function approaches. Put differently, CRISPR/Cas has valuable applications for both basic fish research and the aquaculture industry.

The primary aim of this thesis was to implement new CRISPR-based gene editing tools in Atlantic salmon. This aim was the focus of Paper I and Paper II, where we tested CRISPR/LbCas12a technology and base editing. The secondary aim included using CRISPR-based tools to make in vivo models that can increase our understanding of biological processes related to the Atlantic salmon immune system. This aim is covered in the final manuscript, Paper III, where CRISPR/Cas9 was applied to knockout the immune genes Immunoglobulin (Ig) M and Interferon gamma (IFNg) in Atlantic salmon.

The experiments in this thesis have been performed by microinjecting fertilized salmon eggs, followed by high-throughput sequencing to reveal the editing outcomes. In Paper I, CRISPR/LbCas12a was used to knock out the pigmentation gene solute carrier family 45 member 2 (slc45a2) gene, resulting in an albino or albino mosaic pigmentation phenotype. We also conducted experiments where templates having a target or non-target strand orientation were added to evaluate the knock-in possibilities of LbCas12a, achieving up to 54% integration efficiency. Finally, LbCas12a and SpCas9 CRISPR complexes were injected in the same individual to compare the two nucleases. Interestingly, they both produced similar mutation rates, but more perfect integration occurred at the LbCas12a cleavage site compared to the SpCas9 cleavage site. In Paper II, the cytidine base editor AncBE4max was used to introduce a premature stop codon in slc45a2. We achieved highly efficient C-to-T conversion of up to 89% of our target base. Some undesired effects such as indels, bystander edits, and conversion of C-to-non-Ts were also observed but in small amounts. In Paper II we also further developed an alternative to base editing, single nucleotide replacement, using conventional CRISPR/Cas9. Here, templates featuring point mutations at various positions from the cleavage site were added, revealing that the insertion efficiency was affected by the mutation’s distance from the cleavage site.

In Paper III, we employed CRISPR/Cas9 to successfully knock out the two IgM heavy chain loci in Atlantic salmon, achieving more than 95% mutagenesis at both target sites. Mutagenesis on the IFNg target site(s) was found to be approximately 57%, although with some uncertainty. The investigations regarding IFNg were therefore postponed but may be interesting for future studies. The effect of the IgM knockout on protein level was assessed by flow cytometry analysis and revealed a mean average reduction in IgM positive (IgM+) B cells of 91% in peripheral blood of the gene-edited salmon.

In conclusion, we have implemented two new methods for making genetic changes in Atlantic salmon, CRISPR/LbCas12a and base editing, expanding the toolkit for gene editing in this species. We also employed CRISPR/Cas9 to generate a F0 IgM+ B cell-deficient Atlantic salmon, which may serve as a model to elucidate the role of this key gene and our understanding of the Atlantic salmon immune system in general.