Akutt intermitterende porfyri- kartlegging av funksjonelle og termodynamiske eigenskapar til hydroksymetylbilan syntase og utvalte mutantar

Abstract

Acute intermittent porphyria (AIP) is an inherited disorder. The majority of patients diagnosed with AIP have half-normal activity of hydroxymethylbilane synthase (HMBS), the third enzyme in the heme- pathway. Although the loss of activity originates from mutations in the HMBS gene, the mechanisms involved remain unclear. Functional studies on wt and disease-causing mutations found in various parts of the enzyme, may give valuable information about the specific mutant and factors leading to an AIP attack. The mutations in this study include R116W, K132N, R167W, R173W and V215E, representing either mutation around the active site predicted to interfere with proper binding of the cofactor and/or substrate or mutations far from the active site possibly affecting overall folding and/or flexibility. K132N and V215E are here described for the first time. The recombinant human wt-HMBS and selected mutations were expressed in E. coli using a pGEX expression vector and purified by affinitychromatography. The characterization included enzyme activity and thermostability measured by circular dichroism and differential scanning fluorimetry (DSF). K132N and V215E showed significantly lower activity than the wt, the other mutations had very low activity as expected. R116W and R173W also had low thermostability compared to the wt.V215E showed two peaks on the DSF plot, indicating different unfolding than the wt. Results taken together match findings from patient samples and have enabled us to classify the novel mutants. Together with future studies, this work will lead to improved understanding of the underlying mechanisms of AIP.

Akutt intermitterende porfyri (AIP) er ein arveleg sjukdom. Dei fleste AIP pasientar har om lag 50 % reduksjon i hydroxymetylbilan syntase (HMBS) aktiviteten, det tredje enzymet i hemesyntesen. Sjølv om tap i aktivitet skuldast mutasjonar i HMBS genet, er mekanismane bak ikkje fullt ut forstått. Funksjonelle studiar på wt og sjukdomsframkallande mutantar i ulike delar av enzymet kan gi verdifull informasjon om den spesifikke mutanten og faktorar som bidrar til at pasientar opplever anfall knytt til AIP. Denne studien omfattar mutantane; R116W, K132N, R167W, R173W og V215E. Disse representerar mutasjonar rundt det aktive setet som kan påverke binding til kofaktoren og/eller substrat eller mutasjonar langt frå det aktive setet som kan påverke folding og stabilitet. K132N og V215E blir i denne studien skildra for fyrste gong. Rekombinant humant wt-HMBS og utvalte mutantar blei uttrykt i E.coli ved bruk av pGEX vektor og reinsa med affinitetskromatografi. Karakteriseringa inkluderte enzym aktivitet, og termostabilitet analysert på circular dichroism og differential scanning fluoremetry (DSF). Mutantane K132N og V215E viste signifikant lågare enzym aktivitet enn wt, dei andre mutantane viste svært låg aktivitet som forventa. R116W og R173W var mindre termostabile enn wt. V215E viste to "toppar" på DSF temperaturskannet noko som tydar på ulik utfolding i forhold til wt. Saman med pasientresultat frå Norsk Porfyriregister har vi sett på geno-fenotype samanhengar for dei ulike mutantane for betre kunne seie noko om betydinga av dei enkelte mutasjonane. Denne informasjonen vil føre til betre forståing av dei underliggande mekanismane for AIP.