Fabry disease model in Zebrafish : Studying molecular mechanisms of Fabry nephropathy in a Gb3-free environment

Abstract

Bakgrunn: Fabry sykdom (FS) er en X-bundet lysosomal avleiringssykdom betinget i mutasjon i alfa-galactosidase genet (GLA). Enzymet alfa-galactosidase A (α-GAL) er ansvarlig for nedbryting av fettstoffet globotriaocylceramid (Gb3). Redusert enzymaktivitet fører til Gb3-avleiring i ulike celletyper med organpåvirkning spesielt av nervesystem, hjerte og nyrer. Enzymerstatningsterapi er vist å kunne redusere Gb3-avleiringer, mens det på tross av fjerning av Gb3 synes å være metabolske forstyrrelser som en ikke får bukt med. For å avklare hvilke mekanismer som er direkte knyttet til Gb3 og hvilke ikke, har vi etablert en Fabry modell i zebrafisk (ZF). ZF mangler fra naturens side Gb3 og gir oss mulighet til å utforske Gb3-uavhengige mekanismer og nye potensielle medikamentelle angrepspunkt ved FS.

Metode: Basert i tilgjengelige online data på GLA og α-GAL i ZF, lagde vi ved hjelp av CRISPR/Cas9 gen-editering en GLA-mutert ZF. α-GAL ble målt med standard enzymaktivitet metodologi og fordelingen av enzym i nyrevev ble evaluert ved hjelp av immunhistokjemi. Proteinuri ble målt hos voksne ZF som mål på nyrefunksjon. Vi gjennomførte transcriptomics via RNA sekvensering, proteomics via massespektrometri (MS), oxidativ stress kolometri, immunhistokjemi og elektromikroskopi på nyrevev fra både mutert og ikke-mutert ZF. Vi gjennomførte også plasma metabolom analyse ved hjelp av liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS).

Resulter og konklusjon: Forsøkene våre indikerte at reduksjon av α-GAL-aktiviteten til omtrent to tredeler i ZF ga en FD renal fenotype på funksjonelt nivå uavhengig av Gb3-avleiring. Funnene hos mutert ZF taler for lysosomal og mitokondriell dysfunksjon samt morfologiske forandringer i nyrevev. Metabolitt analyser viste potensielle Gb3-uavhengige nyreskade biomarkører. Disse innovative resultatene gir støtte til at det er Gb3-uavhengige mekanismer ved FS og legger grunnlag for videre forskning for bedre å forstå de patofysiologiske mekanismene samt for utforskning av nye medikamentelle muligheter ved denne sykdommen.

Background: Fabry Disease (FD) is an X-linked lysosomal storage disorder caused by different galactosidase alpha gene (GLA) gene mutations. GLA produces the alpha-galactosidase A (α-GAL) enzyme, which is responsible for the degradation of Globotriaosylceramide (Gb3). Inactive or partially active enzyme results in systemic accumulation of Gb3 throughout the body, the main affected organs being the brain, heart, and kidney. Enzyme replacement therapy can lower the Gb3 load from the cells yet cannot reverse the molecular cell alterations. These alterations are believed to be Gb3-dependent or independent. A main issue currently is to find a clear distinction between these two types of alteration. To address this issue, we have established an FD model in ZF that naturally lacks Gb3 enabling us to trace the Gb3-independent alterations and possibly assist in better disease management by identifying potential drug targets.

Methodology: We investigated the gla gene and the α-Gal enzyme in ZF using the available online databases, and accordingly, we used a CRISPR/Cas9 gene editing approach to produce gla mutant ZF. We measured α-Gal enzyme activity using a standard enzyme activity assay and documented the enzyme kidney tissue distribution in the mutant and wild type fish using immunohistochemistry. We measured proteinuria of adult ZF to evaluate renal function. We conducted transcriptomics via RNA sequencing, proteomics analysis via mass spectrometry (MS), oxidative stress colorimetric assay, immunohistochemistry, and electron microscopy image analysis on the kidney tissue from the mutant and the wild type fish. We also conducted plasma metabolome analysis using Liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS).

Results and conclusion: Our results indicated that lowering the α-Gal enzyme activity by approximately 2/3 in our ZF mutant line results in FD renal phenotype highlighted by alterations at the molecular, subcellular, functional levels independent of Gb3 accumulation. Our results indicated lysosomal dysfunction resulting in evidently mitochondrial functional and morphological alteration in the kidney tissue of the mutant fish. Additionally, metabolite analysis results found potential Gb3-independent renal impairment biomarkers. These innovative results strongly support the Gb3-independent alterations previously reported in FD and lay the ground for further investigation to better understand the FD pathophysiology. Our results also pave the way to better-tailored disease management by revealing potential drug targets.