Functional characterisation of polybasic motifs in the nucleolar PtdIns(3,4,5)P3- interacting proteins proliferation-associated protein 2G4 and poly(ADP-ribose) polymerase 1

Abstract

Fosfoinositid 3-kinase (PI3K)-signalveien er viktig for flere cellulære prosesser, inklusiv celleoverlevelse, proliferasjon og proteinsyntese. Den er godt beskrevet i cytoplasmaet. I tillegg kan fosfatidylinositol 3,4,5-trisfosfat (PtdIns(3,4,5)P3), nøkkellipidet til PI3K-signalveien, påvises i nukleolen sammen med andre komponenter i signalveien, inkludert den katalytisk isoformen PI3K p110β. Nukleolen er hovedstedet for ribosombiogenese, og denne prossen ble funnet å være regulert av PI3K-signaleveien. PtdIns(3,4,5)P3 utøver sine funksjoner ved å interagere med proteiner gjennom strukturerte domener og polybasiske (K/R) motiver. Interaksjonsmåten til strukturerte domener er godt forstått, men hvordan polybasiske motiver binder seg til proteiner er stort sett ukjent. I denne oppgaven ønsket vi å belyse rollen til PI3K-veien i nukleolen, rollen til polybasiske motiver i PtdIns(3,4,5)P3- interagerende proteiner, samt deres interaksjonsmåte. Ved bruk av et nytt biokjemisk verktøy ble spesifisiteten til PtdIns(3,4,5)P3- signalet bekreftet i kjernen til HeLa og museembryonale fibroblastcellelinjer, og vi oppdaget at nivåene endret seg i løpet av cellesyklusen. Videre påvirket aktiviteten til p110β antall og størrelse på nukleoler. For å belyse rollen til PI3K-signalveien i nukleolen, søkte vi å identifisere nedstrøms PtdIns(3,4,5)P3-effektorer. Blant flere andre proteiner ble nukleofosmin (NPM1), poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) og proliferasjonsassosiert protein 2G4 (PA2G4) identifisert som nukleære PtdIns(3,4,5)P3-bindende proteiner. PARP1 og PA2G4 har polybasiske motiver som ble vist å fungere som PPIn-interaksjonssteder. De eksakte lysinene hadde tidligere blitt identifisert i PA2G4. I dette arbeidet tillot molekylære docking-studier oss å finne spesifikke lysinrester i PARP1 som bør karakteriseres ytterligere. Med fokus på PA2G4, som har to K/R-motiver, ett i N- og ett i C-terminalen av proteinet, fant vi at begge motivene er viktige for PA2G4-mediert celleproliferasjon. Spesielt Cterminalen, som tidligere ble funnet å være ansvarlig for dens nukleolære lokalisering, ble vist å være viktig for rRNA-syntese og proteintranslasjon. Videre var nukleolær nærvær av PA2G4 avhengig av p110β-aktivitet. Vi fant at PA2G4 interagerer med NPM1 via begge K/R-motiver, og interaksjonen ble modulert av aktiviteten til p110β. Overekspresjon av PA2G4 WT i kreftceller viste en økning i global proteintranslasjon, celleproliferasjon og levedyktighet. Mutasjoner på det C-terminale K/R-motivet ble identifisert i tumorprøver, slik som K372Rfs-rammeskiftmutanten, som økte antallet nukleoler og celleproliferasjon. Avslutningsvis konkluderer vi med at er PI3K-signalveien aktiv i nukleolus, og dette bidrar til nukleolær arkitektur, til nukleolær tilstedeværelse av PtdIns(3,4,5)P3- effektorproteinene NPM1 og PA2G4 så vel som til deres interaksjon. Dessuten er den nukleolære lokaliseringen og funksjonen til PA2G4 avhengig av K/R-motivene. En PA2G4-tumormutasjon i det C-terminale K/R-motivet bidrar til nukleolære endringer som korrelerer med økt celleproliferasjon i kreftceller. Hvordan PtdIns(3,4,5)P3 regulerer disse prosessene er imidlertid fortsatt uklart, og dette krever ytterligere forskningsinnsats.

The phosphoinositide 3-kinase (PI3K) pathway is important for several cellular processes like cell survival, proliferation, protein synthesis and is well described in the cytoplasm. In addition, phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3), the key signalling lipid of the PI3K pathway, can be found in the nucleolus together with other components of the pathway, including the PI3K p110β catalytic isoform. The nucleolus is the main site for ribosome biogenesis, and it was found to be regulated by the PI3K pathway. PtdIns(3,4,5)P3 exerts its functions by interacting with proteins through structured domains and polybasic (K/R) motifs. The mode of interaction of structured domains is well understood but how polybasic motifs bind to proteins is largely unknown. In this thesis, we sought to discover the role of the PI3K pathway in the nucleolus, the role of polybasic motifs in PtdIns(3,4,5)P3-interacting proteins as well as their mode of interaction. With the use of a new biochemical tool, the specificity of the PtdIns(3,4,5)P3 signal was confirmed in the nucleolus of HeLa and mouse embryonic fibroblast cell lines, and we discovered that its levels changed during the cell cycle. Furthermore, the activity of p110β influenced the number and size of nucleoli. To elucidate the role of the PI3K pathway in the nucleolus, we sought to identify downstream PtdIns(3,4,5)P3 effectors. Amongst several other proteins, nucleophosmin (NPM1), poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1), and proliferation-associated protein 2G4 (PA2G4) were identified as nuclear PtdIns(3,4,5)P3 binding proteins. PARP1 and PA2G4 harbour lysine-rich polybasic motifs that were demonstrated to act as PPIn interaction sites. The exact lysines had previously been identified in PA2G4. In this work, molecular docking studies allowed us to pinpoint specific lysine residues in PARP1 that should be further characterized. Focusing on PA2G4, which harbours two PBRs, one in the N- and one in the C-terminal of the protein, we found that both motifs are important for PA2G4- mediated cell proliferation. The C-terminal motif, in particular, which was previously found to be responsible for its nucleolar localisation, was shown to be important for rRNA synthesis and protein translation. Furthermore, the nucleolar presence of PA2G4 was dependent on p110β activity. We found that PA2G4 interacts with NPM1 through both PBRs and the interaction was mediated by the activity of p110β. Overexpression of PA2G4 WT in cancer cells showed an increase in global protein translation, cell proliferation, and viability. Mutations on the C-terminal PBR were identified in tumour samples, such as the K372Rfs frameshift mutant, which increased the number of nucleoli and cell proliferation. In conclusion, the PI3K pathway is active in the nucleolus, and this contributes to nucleolar architecture, to the nucleolar presence of the PtdIns(3,4,5)P3 effector proteins NPM1 and PA2G4 as well as to their interaction. Moreover, the nucleolar localisation and function of PA2G4 are dependent upon its PBRs. A PA2G4 tumour mutation in the C-terminal PBR contributes to nucleolar alterations which correlate with increased cell proliferation in cancer cells. However, how PtdIns(3,4,5)P3 regulates these processes is still unclear and this warrants further research efforts.