Correlating local and systemic tumor-associated inflammation in colon cancer : CRP and the tumor immune microenvironment

Abstract

Bakgrunn: Markører for systemisk inflammasjon er assosiert med dårlig prognose i en rekke ulike kreft typer, inkludert tykk- og endetarms kreft (CRC). I dette prosjektet fokuseres på betydningen av systemisk tumor-assosiert inflammasjon bestemt ved måling av CRP i blodet hos pasienter med resektabel metastatisk og lokalisert tykktarmskreft. Det overordnede formål var å øke forståelsen av hvorfor systemisk inflammasjon og forhøyet CRP er så ugunstig for prognose og sykdoms forløp hospasienter med tykktarmskreft. Mens tidligere forskning primært har fokusert på betydningen av systemisk og lokal tumor assosiert inflammasjon hver for seg, ønsket vi å undersøke korrelasjonen mellom de to og hvorvidt særlige immunologiske karakteristika er uttrykt i primær svulsten hos pasienter med forhøyet CRP verdi i blodet. Nyere forskning har vist at CRP eksisterer i ulike isoformer; sirkulerende CRP som er en pentamer (pCRP) og vevs-assosiert monomert (mCRP), som har pro inflammatoriske egenskaper. Vi ønsket derfor å undersøke hvorvidt mCRP var til stede i tumormikromiljøet (TME) i en kohorte med tykktarmskreft pasienter med og uten forhøyet CRP i blodet.

Metode: I den første del av prosjektet (paper 1) evaluerte vi den prognostiske verdi av preoperativ CRP i en nordisk kohorte bestående av 425 stadium IV CRC pasienter med levermetastaser behandlet med kurativt intendert leverreseksjon. I den andre og primære del av prosjektet (paper 2 og 3), foretok vi immunhistokjemisk undersøkelse av tumor vev fra 43 pasienter med stadium II og III tykktarmskreft som fikk fjernet primær tumor på Sørlandet Sykehus i perioden 2005 og 2015. For karakterisering av immunuttrykket i primær svulsten fra disse pasientene utviklet vi en metode basert på formalin fiksert parafin innstøpte (FFPE) fullsnitt, som kombinerer multiplex immunhistokjemi (mIHC) og digital analyse for presis visualisering og kvantifisering av syv ulike lymfoide og myeloide immun markører med bevart vevs morfologi. Ved bruk av denne analyse plattformen kunne vi få omfattende informasjon om immun celle sammensetning, distribuering og spatiale mønstre i TME hos pasienter med og uten forhøyet CRP-verdi i blodet.

Resultater: I det første materialet fant vi at preoperativ CRP > 10 mg/L var en sterk negativ prognostisk markør uavhengig av andre tumor- og pasientrelaterte faktorer hos CRC pasienter operert for levermetastaser. Ved å undersøke immunuttrykket i primær svulsten hos pasienter med tykktarmskreft med og uten forhøyet CRP verdi i blodet, fant vi at svulster fra pasienter med tegn på systemisk inflammasjon (CRP>30 mg/L) overveiende var mer myeloid inflammerte, særlig i form av høyt uttrykk av neutrofile, sammenlignet med svulster fra pasienter med normal CRP (CRP 0-1 mg/L). Samlet viste våre immunanalyser at det er grad av myeloid inflammasjon (målt ved å kombinere ekspresjonen av CD66b+ neutrofile og CD68+ makrofager) i TME og ikke fravær av lymfoid inflammasjon (målt ved å kombinere ekspresjonen av CD8+ og CD4+ T-celler) som korrelerer med den systemiske inflammatoriske respons. Ved bruk av et mCRP spesifikt antistoff, fant vi at mCRP var uttrykt i tumor, men ikke i nærliggende normal vev. Tumor-assosiert mCRP var sterkt korrelert med CRP verdien i blodet. Dobbel IHC viste co-lokalisasjon med neutrofile, endotel celler og enkelte tumor celler, hvilket indikerer at mCRP potensielt kan spille en direkte rolle i TME hos pasienter med systemisk inflammasjon.

Konklusjon og perspektiver: Samlet fremhever dette prosjektet den sterke betydningen av systemisk inflammasjon og forhøyet CRP for prognose i en bred populasjon av CRC pasienter. Måling av CRP-verdien i blodet er lett tilgjengelig og forbundet med lave kostnader. Inkorporering av CRP og informasjon om pasienters systemiske inflammatoriske status bør, sammen med andre kliniske, patologiske og molekylære funn, inngå i den samlede evaluering av kreft pasienter. En slik helhetlig pasient vurdering kan bidra til mer presis prognose og hjelpe klinikeren til å foreta persontilpassede behandlingsvalg. Våre funn indikerer at CRP-verdien i blodet kanreflektere typen av immun respons lokalt i kreftsvulsten. Av særlig interesse, viser vi at CRP muligvis er mer enn en passiv biomarkør, som potensielt kan spille en aktiv rolle i kreftsvulster. Dette åpner et nytt perspektiv på hvorfor forhøyet CRP er så uhensiktsmessig for kreftpasienters forløp og prognose, og kan potensielt et nytt target for kreftbehandling. Videre forskning er nødvendig for å avklare CRPs fulle potensiale som biomarkør og mulig direkte aktør ved kreftsykdom.

Background: Biomarkers of systemic inflammation have consistently been associated with poor patient outcomes in various cancer types, including colorectal cancer (CRC). In the present work, we focus on the role of tumor-associated systemic inflammation as assessed by elevated levels of serum CRP in resectable metastatic and non-metastatic CRC patients. Overall, we aimed to improve the understanding of why elevated CRP is so detrimental for prognosis. While previous work in the field of tumor immunology predominantly has focused on the systemic and local tumor immune responses separately, we were interested in assessing the relationship between the two to get a better comprehension of the inflammatory state associated with elevated CRP and poor clinical outcomes. Considering emerging evidence that CRP exists in two distinct isoforms, circulating pentameric CRP (pCRP) and the pro-inflammatory tissue-associated monomeric form (mCRP), we aimed to investigate whether mCRP was expressed in the tumor microenvironment (TME) of a cohort of colon cancer (CC) patients with and without elevated circulating CRP.

Method: In the first part of the project (paper 1), we evaluated the prognostic impact of preoperatively measured CRP in a Nordic cohort of 492 stage IV CRC patients undergoing potentially curative resection of liver metastases. In the second and main part of the project (paper 2 and 3), we performed immunohistochemical staining of tumor tissue from 43 stage II and III colon cancer patients resected for their primary tumors at Sørlandet Hospital between 2005 and 2015. For exploring the tumor immune microenvironment, we developed a formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE)-based platform combining multiplex immunohistochemistry (mIHC) and digital whole slide imaging enabling accurate visualization and assessment of seven simultaneously expressed both lymphoid and myeloid immune markers with preserved tissue morphology covering entire tissue sections. Using this platform, we could get comprehensive information regarding cellular composition, distribution, and spatial patterns in the TME allowing us to explore and compare the tumor immune contexture in colon cancer patients with and without systemic inflammation.

Results: We found that preoperatively elevated CRP (>10 mg/L) was a strong negative prognostic marker in CRC patients with liver metastases undergoing potentially curative liver surgery independent of other tumor and patient related factors. By exploring the tumor immune microenvironment in CC patients with and without elevated CRP, we found that systemically inflamed patients (CRP>30 mg/L) harbored a more myeloid-dominated TME compared to non-inflamed patients (CRP 0-1 mg/L), suggesting a particular strong, potential driving role of neutrophils. Importantly, our data showed that it is the presence of myeloid inflammation (evaluated by acompounded score of CD66b+ neutrophils and CD68+macrophages) rather than the absence of lymphoid inflammation (evaluated by a compounded score of CD4+ and CD8+ T-cells) that correlates with systemic inflammation. Utilizing an mCRP specific antibody, we found that mCRP was abundantly present within tumors, but not in adjacent normal colon mucosa. Tumor-associated mCRPcorrelated strongly with circulating CRP. Double IHC revealed co-localization of mCRP with neutrophils and endothelial cells as well as some tumor cells, suggesting that mCRP may play a direct role in the microenvironment of tumors in CC patients presenting with systemic inflammation.

Conclusion and perspectives: Taken together, this work advances our comprehension of the profound role of systemic inflammation and elevated CRP for prognosis in a broad population of CRC patients. Measurement of CRP is inexpensive and routinely available. Incorporating CRP and information on the systemic inflammatory status alongside other clinical, pathological, and molecular features, as part of overall patient evaluation, may allow for more precise prognostication and accurate assessment of individual patient`s disease status and help clinicians tailor appropriate and more personalized treatment strategies. Focusing on the tumor immunology behind elevated CRP, the findings presented herein provide support for CRP as an informative biomarker reflecting features of the immune response occurring at the tumor site. Intriguingly, introducing a new perspective to why elevated CRP in cancer patients is so detrimental, findings within this work suggest that CRP, might not only be a passive bystander, but also an active player within tumors and opens a potential novel approach for cancer treatment. Further progress in this area is needed to uncover the full potential and clinical utility of CRP as a biomarker and potential contributor in cancer patients.