Novel Methods and Sources for Regeneration of Oral Mucosa

Abstract

Background: Common clinical approaches for replacing damaged oral mucosa are represented by autologous skin grafts which have numerous shortcomings and pose serious post-surgical morbidity. Cultured oral mucosal sheets have been developed in academic research laboratories and few models have even been commercialized, but they also present limitations and are not feasible yet for use in clinics. There is a need to develop alternative methods for the regeneration of oral mucosa that employ more robust and efficient sources of epithelial cells for generation of oral mucosal sheets.

Aims: i) to identify the factors responsible for oral epithelial differentiation for generating oral mucosal sheets (Paper I); ii) to isolate and characterize cells derived from human epithelial rests of Malassez (ERM) and compare them with cells derived from matched normal oral mucosa (NHOM) with regards to their ability to generate oral mucosal sheets (Paper II); iii) to test whether pluripotent embryonic stem cells (ESC) can be differentiated into oral epithelium (Paper III); iv) to test whether induced pluripotent stem cells (iPSC) derived from adult human fibroblasts can be differentiated into keratinocytes which can further be used for the generation of oral mucosal sheets for regenerative therapies (Paper IV).

Materials and methods: Different sources of cells were used for generation of oral mucosal sheets, i.e., normal oral keratinocytes (NOK) isolated from NHOM (Paper I), ERM cells isolated from human periodontal ligament (Paper II), mouse ESC (Paper III), and iPSC reprogrammed from human normal oral and dermal fibroblasts (Paper IV). The cells were characterized by flow cytometry, immunohistochemistry (Paper II, III and IV), immunofluorescence (Paper III and Paper IV), and RT-qPCR (Paper IV). Three dimensional organotypic (3D OT) cultures were constructed using these cells and different growth factors, such as granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) and keratinocyte growth factor (KGF) (Paper I), or exposure to different extracellular matrix (ECM) components were used to differentiate them into epithelial lineages (Paper III). In Papers II and IV, 3D OTs were constructed using alternative human sources for oral epithelial cells (ERM and iPSCs), which were compared to the 3D OTs constructed with NOK cells derived from NHOM.

Results: In Paper I, it was revealed that major aspects of NOK differentiation into a mature oral epithelium in 3D OTs were regulated by the combination of GM-CSF and KGF. The terminal stage of the differentiation seemed to be however controlled by other yet unidentified fibroblast-derived diffusible factor(s). In Paper II, the ERM cells contained various proportions of PanCK positive cells and showed a network pattern of growth similar to the network of ERM around the root of the tooth, while NOK formed a uniform, continuous sheet of cells. When grown in 3D OT or in collagen gels, ERM cells formed a less differentiated epithelium than NHOM cells, yet expressing PanCK and vimentin. Data from Paper III confirmed that vitamin C alone could enhance the number of mouse ESC expressing epithelial markers, but the ECM synthesized by either oral or skin fibroblasts or keratinocytes was required to induce the expression of a stratified epithelial phenotype. Further 3D OT culture under vital fibroblast instruction was necessary for further differentiation into mature, regionally relevant epithelial structures, and only the ESC firstly ‘primed’ in 2D on keratinocyte or fibroblast derived ECMs reached a final epithelial maturation stage in 3D OT cultures as revealed by immunohistochemical staining. In Paper IV, iPSC derived from normal oral and skin fibroblasts were differentiated into keratinocytes using both growth factor and ECM-enriched protocols. These keratinocytes were morphologically and phenotypically comparable to normal adult keratinocytes. Furthermore, iPSC could be also differentiated into keratinocytes in xenofree conditions and used for generation of oral mucosal sheets. Taken together these results indicate iPSC from oral and skin adult fibroblasts as a promising to generate oral mucosal sheets for regenerative therapies.

Conclusions: Overall, this thesis provides new knowledge on the mechanisms of differentiation of oral epithelium and the proof of principle for a novel biomedical application of keratinocytes differentiated from alternative sources such as iPSCs to generate oral mucosal sheets for regenerative therapy.

Bakgrunn: Dersom man skal erstatte skadet munnslimhinne er det vanlig å bruke autolog hudtransplantasjon, men å bruke hud som erstatning for munnslimhinne har flere begrensninger og gir ofte en dårlig tilheling. Man har greid å dyrke kunstig munnslimhinne i laboratoriet, og slik kunstig slimhinne er også tilgjengelig kommersielt. Men også denne har begrensninger og kan ikke brukes klinisk. Derfor er det behov for å utvikle alternative metoder for å få en bedre tilheling i munnslimhinne, med mer robuste epitelceller som også er lettere tilgjengelige.

Mål: i) å identifisere hvilke faktorer som er nødvendige for å utvikle epitel fra munnslimhinne (Artikkel I); ii) å isolere og karakterisere celler som er utgått fra Malassezske epitelrester (ERM) og sammenligne dem med celler utgått fra celler fra normal munnslimhinne (NHOM) fra samme person, med hensyn på evne til å utvikle en kunstig munnslimhinne (Artikkel II); iii) å teste om pluripotente embryonale stamceller (ESC) kan differensieres til oralt epitel (Artikkel III); iv) å teste om induserte multipotente stamceller (iPSC) utviklet fra modne humane fibroblaster kan differensieres til keratinocytter, som videre kan nyttes for å utvikle en kunstig munnslimhinne til behandling av skader i munnslimhinnen (Artikkel IV).

Materiale og metoder: Celler fra flere ulike vev ble brukt for å utvikle kunstig munnslimhinne, f.eks. normale keratinocytter fra munnslimhinne (NOK) isolert fra NHOM (Artikkel I), celler isolert fra rothinnespalten (Artikkel II), embryonale stamceller fra mus (Artikkel III) og iPSC som var reprogrammert fra humane fibroblaster fra munnslimhinne og hud (Artikkel IV). Cellene ble karakterisert med væskestømcytometri, immunhistokjemi (Artikkel II, III og IV), immunfluorescens (Artikkel III og IV) og RT-qPCR (Artikkel IV). Tredimensjonale organotypiske (3D OT) kulturer ble konstruert med de ulike celletypene sammen med ulike vekstfaktorer som granulocytt makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) og keratinocytt vekstfaktor (KGF) (Artikkel I), eller å eksponere dem for ulike medier for å utvikle dem videre til epitelceller (Artikkel III). I Artikkel II og IV ble det konstruert 3D OT ved å bruke alternative kilder av epitelceller fra munnslimhinne, og disse ble sammenlignet med kunstig munnslimhinne utviklet fra NHOM.

Resultater: I Artikkel I ble det vist at differensiering av NOK til fullt utviklet oralt epitel i 3D OT ble regulert av en kombinasjon av GM-CSF og KGF. Det siste stadiet av utviklingen ble imidlertid kontrollert av en foreløpig ikke identifisert løselig faktor fra fibroblastene. I Artikkkel II ble det vist at cellene isolert fra ERM inneholdt varierende mengder av Pan CK positive celler, og at vekstmønsteret var ulikt sammenlignet med NOK fra NHOM. Når cellene isolert fra ERM ble dyrket i 3D OT eller i kollagengeler, dannet ERM cellene mindre differensiert epitel sammenlignet med celler fra NHOM, men de uttrykte både PanCK og vimentin. Data fra Artikkel III bekreftet at vitamin C alene kunne øke antall celler fra mus, som uttrykte ESC epiteliale markører, men for å danne epiteliale celler var det nødvendig med ektracellulær matriks (ECM) som var syntetisert av fibroblaster fra enten munnslimhinne eller hud. Fibroblastene var også nødvendige for en videre differensiering til modne epiteliale celler, og bare ESC som var først dyrket i 2D på keratinocytt- eller fibroblastderivert ECM oppnådde et fullt utviklet epitel, bekreftet med immunhistokjemi. I Artikkel IV ble iPSC utviklet fra fibroblaster fra normal munnslimhinne og hud differensiert til keratinocytter ved hjelp av ulike vekstfaktorer og ECM-rike medier. Disse keratinocyttene var morfologisk og funksjonelt sammenlignbare med normale keratinocytter fra munnslimhinne og hud. iPSC kunne også bli differensiert til keratinocytter under xenofrie forhold og utviklet videre til kunstig munnslimhinne. Funnene indikerer at iPSC fra fibroblaster fra munnslimhinne og hud kan være en ny mulighet for å utvikle keratinocytter som kan brukes i regenerativ behandling.

Konklusjoner: Samlet gir denne avhandlingen ny kunnskap om differensieringen av epitel fra munnslimhinne og viser prinsippene for hvordan keratinocytter som er differensiert fra alternative kilder kan brukes til å utvikle kunstig munnslimhinne til regenerativ behandling.