Deciphering rare imprinting disorders within the Beckwith-Wiedemann spectrum

Abstract

Beckwith-Wiedemann syndrom (BWS) er den hyppigste og mest komplekse tilstanden blant imprintingssykdommene. Avhandlingen presenterer tre ulike BWS spektrum familier, hvor vi utvider forståelsen av arvemønsteret ved BWS, og viser hvor viktig en presis diagnose er med tanke på individuell oppfølging av f.eks kreftrisiko og svangerskapskomplikasjoner, men også gjentakelsesrisiko i familien. Vi presenterer også en kompleks genvariant i CDKN1C som vi foreslår forårsaker ikke bare en, men hele tre ulike tilstander samtidig, bl.a grunnet en ikke tidligere beskrevet isoform av proteinet som kan tenkes å være viktig for hjernens utvikling. I tillegg beskriver vi for første gang en person med et dobbelt kromosomsett (UPD) fra far for to kromosomer (kromosom 7 og 15) som har gitt innsikt i nettverket av imprintede gener. BWS karakteriseres av bl.a svangerskapskomplikasjoner, lavt blodsukker ved fødsel, høy fødselsvekt og stor morkake, stor tunge og store indre organer, midtlinjedefekter i buk og eventuelt tarmbrokk, økt risiko for barnekreft som Wilms tumour, og hos enkelte spesielle ansiktstrekk og mindre utviklingsavvik. Som hovedregel er den psykomotoriske utviklingen normal. Imprinting er en viktig genreguleringsmekanisme som ikke innebærer endringer i selve DNA-koden, men derimot en reversibel epigenetisk endring av DNA vha cytosin-metylering av hovedsaklig CpG posisjoner. For enkelte gener er ikke bare regulering av gendosen men også genkilden viktig, dvs om genet uttrykket på det kromosomet som er arvet fra mor eller fra far. Dette kalles kjønnsavhengig imprinting. Ved feil i dette kjønnsavgengige imprintingsystemet oppstår imprintingsykdommene. Ved BWS styres imprintingen av to imprintingssentre, IC1 og IC2, på den aktuelle kromosomregion på enden av kromosom 11 (11p15.5). I en normal situasjon er vektsfaktoren IGF2 i IC1 kun aktivt på genkopien nedarvet fra far, mens veksthemmeren CDKN1C i IC2 kun uttrykkes fra genkopien nedarvet fra mor. 7 Metyleringsforstyrrelser i et (eller begge) av de to imprintingssentrene medfører BWS. Den hyppigste årsaken er sporadisk tap av metylering i IC2 på 11p15.5, som bl.a medfører at veksthemmeren CDKN1C slås helt eller delvis av. BWS kan også skyldes økt metylering av det maternelle IC1 som fører til at vekstfaktoren IGF2 også uttrykkes fra mors genstreng, ikke bare fra fars. En slik økt metylering av IC1 kan være sporadisk, men kan også skyldes underliggende avvik i IC1 sin DNA sekvens, som kan nedarves og gi BWS dersom nedarving via morsledd. Artikkel I beskriver en en slik familie, hvor familiemedlemmer i tre generasjoner har en sjelden IC1-genfeil som gir opphav til dominant arvelig BWS dersom maternell nedarving. Denne formen for BWS er forbundet med risiko for nyrekreft hos barn. Vi viser også at BWS symptomene øker fra andre til tredje generasjon (antesipasjon) og samtidig korrelerer med metyleringsgraden i IC1. Dette er ikke tidligere beskrevet ved imprintingssykdommer. Vi presenterer en hypotese for å forklare denne antesipasjonen. Som forventet medfører genfeilen forstyrrelse av skifte av metyleringsmønster på fars kromosom 11 i hans datters eggstokker, dvs at demetyleringen er inkomplett her. Det nye her er at denne metyleringsfeilen forsterkes til neste generasjon, dvs hos datterens barn, selv om genfeilen nå sitter på et maternelt nedarvet kromosom. Dette antyder at metyleringen på det maternelle kromosom 11 passivt nedarves til neste generasjon gjennom kvinneledd, mens kun det paternelle kromosom 11 aktivt demetyleres, altså at mors og fars BWS-regioner på kromosom 11 behandles ulikt i eggstokkene. Artikkel II presenterer en familie med en kompleks variant i CDKN1C, som medfører både tap og økning av genfunksjon, slik at gutten har en unik kombinasjon av både BWS-lignende overvekst og en veksthemming. Sistnevnte minner om speilbildetilstanden til BWS som kalles IMAGe. Ved å benytte RNA dypsekvensering viser vi at varianten i tillegg rammer en hittil ikke beskrevet transkriptutgave (isoform) av genet. Vi spekulerer i at genfeil i denne ubeskrevne isoformen kan forklare forsinket utvikling og liten hodeomkrets. Artikkel III presenterer en gutt med en BWS-lignende trekk i tillegg til psykomotorisk utviklingsavvik. Han har normalt kromosomantall, men begge utgaver av både kromosom nr 7 og nr 15 er kun nedarvet fra far (paternelt), dvs at det 8 maternelle kromosom 7 og 15 ikke påvises. Dette kalles paternell uniparental disomi (UPD). Når UPD rammer kromosom som inneholder imprintede gener, kan imprintingsykdom oppstå. Begge disse kromosomene inneholder en rekke imprintede gener. Paternell UPD(15) er en av årsakene til Angelman syndrom, en velkjent imprintingssykdom som medfører psykomotorisk utviklingshemming, mens paternell UPD(7) ikke er assosiert med noen kjent imprintingssykdom. Vi finner imidlertid ingen annen forklaring enn paternell UPD(7) på hans BWS-lignende symptomer, som for øvrig overlapper med det man ser hos pasienter med generell paternell UPD mosaisisme. Ved RNA dypsekvensering finner vi oppregulering av flere vekstrelaterte gener. Mest interessant er en betydelig oppregulering av et imprintet gen på kromosom 7 kalt PEG10, som også kan tenkes å ha betydning for vekst. En slik dobbel UPD er ikke rapportert tidligere, og vi presenterer også en hypotese på hvordan dette har oppstått.

Background: Beckwith-Wiedemann syndrome spectrum (BWSp) is the most common and probably the most complex imprinting disorder in humans. BWSp is caused by different molecular and epigenetic mechanisms involving the chromosome 11p15.5 subdomain and is associated with overgrowth, endocrine disturbances, congenital malformation, and an increased childhood cancer risk. We see many BWSp families in our clinical practice, but the three families described in this dissertation have been selected because of their unique features, atypical inheritance patterns, or novel genetic causes. Objective: We aimed to explore each family's clinical characteristics and the underlying molecular defects and further explain the genotype-phenotype correlation to improve clinical diagnostics and follow-up of these patients. Materials and Methods: Three families were ascertained in our outpatient clinic, and we performed clinical and molecular investigations and gave genetic counseling. We used Sanger sequencing to identify the causal variants in the families described in articles I and II. In article III, SNP array-based copy number analysis in the affected boy revealed double isodisomy. In the family in article I, we determined the methylation status of Imprinting Centre 1 (IC1) in the BWS locus by MS-MLPA (Methylation Specific-Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) and bisulphite conversion followed by both subclone Sanger sequencing and NGS (Next-Generation Sequencing) of CTCF (CCCTC binding factor) binding sites in IC1. We compared the degree of methylation between the generations and between individual CTCF binding sites. In articles II and III, we performed NGS-based RNA deep sequencing to decipher the different CDKN1C transcripts and study the expression of individual genes or gene sets. Trio-based whole-exome sequencing (WES) was performed in articles II and III to exclude other molecular causes of the phenotype. Results: In the three-generations BWS-family described in article I, we found evidence for anticipation through the generations, with increased methylation of IC1 correlating with increased severity of the developmental disturbance. This epimutation was secondary to a previously described heterozygous variant in the 10 OCT binding site NCBI36:11:g.1979595T4C in IC1. In the family presented in article II, an inherited and complex delins-variant in CDKN1C ((NM_000076.2) c.822_826delinsGAGCTG) was detected. This variant probably induced concurrent gain-of-function and loss-of-function effects, which correlated with the mirror phenotypes of both growth restriction and IMAGe features, and overgrowth and BWSp features, both present in the same individual. In addition, this variant affected a hitherto not reported CDKN1C transcript with a different C-terminal reading frame that might explain his developmental delay. In article III, we studied a baby boy with a clinical presentation of BWS, but without a molecular correlate. Here we described for the first time a double uniparental disomy (UPD) affecting two imprinted chromosomes: 7 and 15. This caused paternal isoUPD(7) and isoUPD(15), the latter explaining Angelman syndrome. We also present a hypothesis for how the double UPD arose. However, we did not identify a known molecular explanation for the boy's BSWp, a phenotype reminiscent of general paternal UPD mosaicism. We explored if the UPDs could induce a global imprinting defect, but this was not detected. However, RNA-sequencing detected upregulation beyond expectation (>2 fold) of the maternally imprinted gene PEG10 located to 7q21.3. Possibly, PEG10 overexpression could cause an overgrowth phenotype, but this remains to be proven. Conclusions: This work broadens the phenotypic and molecular spectrum of BWS and highlights the importance of a precise molecular diagnosis for clinical follow-up and recurrence risk. We show that anticipation can also occur in imprinting disorders and hypothesize that the paternal and maternal IC1 alleles are treated differently in the gonads. In addition, we present a hitherto not described CDKN1C transcript which might have importance for brain function. The study also gives insight into the so-called imprinted gene network. We investigated how this specific double paternal UPD(7) and UPD(15) could cause BWSp and ended up with PEG10 overexpression as the most likely mechanism. Intriguingly, the two small, imprinted genes that we have studied, CDKN1C and PEG10, both have multiple reading frames, which is rare in human genes.