Investigating the human small intestinal microbiota : Microbiological characterization of jejunal and ileal samples collected during surgery

Abstract

Kartlegging av tynntarmsmikrobiota hos mennesker : Mikrobiologisk beskrivelse av kirurgiske prøver fra jejunum og ileum

Beskrivelser av tynntarmsmikrobiota (tarmflora) i lærebøker og vitenskapelige artikler er lite konsistente. Nyere studier hevder at distale ileum har en mikrobiota som likner på den i tykktarmen, mens eldre studier i hovedsak rapporterer bakterier fra munn. Mikrobiota i jejunum beskrives også forskjellig i nyere litteratur og ingen vet sikkert om jejunum har en egen kjernemikrobiota.

Forskjellene mellom eldre og nyere studier kan skyldes at man har brukt ulike metoder for å påvise bakterier. Eldre artikler har brukt dyrkningsbaserte metoder mens nyere studier bruker sekvenseringsteknologi. I tillegg er det stor forskjell på å ta endoskopiske prøver via munn eller tykktarm og på å ta prøver direkte fra åpnet tynntarm under kirurgiske operasjoner.

Hovedmålet med dette PhD-prosjektet var å beskrive mikrobiota i jejunum og ileum på arts-nivå og definere en eventuell kjernemikrobiota, altså mikrober som antas å være viktige for funksjonen i tynntarmen vår, for begge segmenter.

Til dette formålet benyttet vi rene kirurgiske prøver fra tarmslimhinnen i proksimale og midtre del av jejunum på pasienter med sykelig overvekt under gastrisk bypass operasjon (n=60 x 2), og fra distale del av ileum på blærekreftpasienter under cystektomi med urinavledning (n=150). Alle prøvene ble dyrket i laboratoriet med standard metoder. I tillegg ble alle prøvene fra jejunum og 30 prøver fra ileum undersøkt med dypsekvensering av V3-V4-regionen av det bakterielle 16S rRNA genet.

Prøvene fra jejunum var dyrkningsnegative hos 51% av pasientene svarende til en mikrobetetthet på mindre enn 103 bakterier per milliliter. Hyppigste dyrkningsfunn var fra Streptococcus salivarius-, S. sanguinis- and S. mitis-gruppene. Dypsekvensering av 16S-rRNA-genet detekterte også lave nivåer av bakterielt DNA, primært fra munnhulebakterier. De fleste artene ble bare sporadisk detektert og vi fant ikke holdepunkt for at det finnes en kjernemikrobiota i jejunum. De hyppigste artene detektert i jejunum ved dypsekvensering (tilstede i 40-48% av pasientene) tilhørte Streptococcus mitis-gruppen, Streptococus sanguinis-gruppen, Granulicatella adiacens/para-adiacens, Schaalia odontolytica-komplekset (tidligere Actinomyces odontolyticus) og Gemella haemolysans/taiwanensis. Hyppigste detekterte genera var Corynebacterium, Streptococcus, Gemella, Granulicatella og Actinomyces.

Sammenliknet med jejunum, var mikrobetettheten vesentlig høyere i ileum ned mot ileocøkal-klaffen. Vi fant mikrober ved dyrkning hos 93% av pasientene, men hos de fleste (79%) bare tilsvarende 1.6 x 104 bakterier per milliliter eller mindre. Hyppigste dyrkningsfunn var gjærsoppen Candida albicans sammen med bakteriearter fra Streptococcus sanguinis- og S. mitis-gruppene. I ileum fant vi også høyere nivåer av mikrobielt DNA (ca. 100-1000 ganger mer enn i jejunum) og det var mulig å definere en kjernemikrobiota. Hyppigste detekterte arter (tilstede i 89-100% av pasientene) var fra Streptococcus mitis- og S. sanguinis-gruppene, Granulicatella adiacens, Schaalia odontolytica-komplekset, Solobacterium moorei, Gemella haemolysans/sanguinis og Rothia mucilaginosa. Hyppigste identifikasjon på genus-nivå var Streptococcus, Granulicatella, Actinomyces, Gemella, Rothia, Solobacterium, TM7(G-1) og Oribacterium.

Vår studie viser at tynntarmsmikrobiotaen hos mennesker er sparsom og dominert av gram-positive bakterier assosiert med munnhulen. Mikroorganismene er hovedsakelig fakultative eller mikroaerofile, selv helt distalt i ileum. De hyppigste detekterte artene både i jejunum og ileum var fra Streptococcus mitis- og S. sanguinis-gruppene i tillegg til Granulicatella adiacens. Vi kunne definere en kjernemikrobiota i ileum, men finner ikke holdepunkt for at jejunum har en egen mikrobiota.

Results from previous characterizations of the small intestinal microbiota (i.e. the ecological community of resident microorganisms) are conflicting. Whereas modern investigations proclaim the presence of a colon-like microbiota in the distal ileum, older studies contradict these results and report bacteria characteristic of the oral cavity. Descriptions of the jejunal microbiota lack consistency and little is yet known as to whether the jejunum has a core microbiota of its own.

Such differences may be owing to different sensitivities of the most commonly used analytic methods – culturing and DNA sequencing, as well as to variations in sampling techniques – transluminal sampling, e.g. endoscopy, versus clean sampling of material from the lumen during surgery.

The main objective of this PhD-project was to perform a species-level description of the jejunal and distal ileal microbiota and to identify potential core-microbial species. Samples were collected surgically from the mucosa of the proximal and mid jejunum in a population with morbid obesity during gastric bypass surgical procedures (n=60 x 2), and from the distal part of the ileum in patients suffering from bladder cancer during cystectomy with urinary diversion (n=150). All samples were cultured using standard methods. In addition, all jejunal and 30 ileal samples were investigated using broad-range amplification and deep sequencing of the V3-V4-region of the bacterial 16S ribosomal ribonucleic acid (16S rRNA) gene.

Jejunal samples were culture-negative in 51% of the participants, corresponding to a bacterial density of less than 103 colony forming units (cfu)/ml. The species most frequently detected by culture belonged to the Streptococcus salivarius group, S. sanguinis group and S. mitis group. Deep sequencing and quantification of the bacterial 16S rRNA gene revealed low levels of typical oral bacteria. Most species were only sporadically detected, and we were not able to find evidence supporting the existence of a core resident jejunal microbiota. The most frequent species in the jejunum by deep sequencing (present in 40-48% of the patients) belonged to the Streptococcus mitis group, the Streptococcus sanguinis group, Granulicatella adiacens/para-adiacens, the Schaalia odontolytica complex (former Actinomyces odontolyticus) and Gemella haemolysans/taiwanensis. The most frequently identified genera were Corynebacterium, Streptococcus, Gemella, Granulicatella and Actinomyces.

The density of microbial organisms was higher in ileum towards the ileocecal valve as compared to results from the jejunal samples. Ninety-three percent of ileal samples were culture-positive. Still, in 79% of the participants only 1.6 x 104 cfu/ml or less were detected. The most frequently cultured microbes in ileum were the yeast Candida albicans and the bacteria of the Streptococcus sanguinis group and the S. mitis group.In the distal ileum, we also found higher levels of microbial DNA (approximately hundred to thousandfold more than in jejunum) and were able to define a core microbiota. The most frequently detected species (present in 89-100% of the patients) were from the Streptococcus mitis group, the S. sanguinis group, Granulicatella adiacens, the Schaalia odontolytica complex, Solobacterium moorei, Gemella haemolysans/sanguinis and Rothia mucilaginosa. At the genus level Streptococcus, Granulicatella, Actinomyces, Gemella, Rothia, Solobacterium, TM7(G-1) and Oribacterium were most frequently detected.

Our data provide evidence that the human small intestine harbors a sparse microbiota dominated by gram-positive bacteria related to the oral cavity. Microorganisms are mostly facultative or microaerophilic even in the distal part of ileum. In both jejunal and ileal samples, the top three most frequent bacteria belong to the Streptococcus mitis group, the S. sanguinis group and Granulicatella adiacens. We were able to define a core microbiota in the ileum but our work does not support the presence of a resident jejunal core microbiota.