Polarized Recruitment of Secretory Vesicles in the Choanoflagellate Salpingoeca rosetta: Insights into the Origin of Neurosecretion

Abstract

Evolusjonen av strengt regulert sekresjon, som i nevroner, markerte et vendepunkt for opprinnelsen og diversifiseringen av ulike celletyper i dyreriket. Spesialiserte regulerte sekretoriske celler brukes i viktige organismeprosesser og -reaksjonsveier, slik som immunitet og forsvar, metabolisme og vekst, og informasjonsbehandling. De evolusjonære opprinnelsene til regulert sekresjon er midlertid i stor grad ukjente. I denne avhandlingen brukte vi choanoflagellater - søstergruppen til metazoer - for å beskrive lokaliseringen og potensielle funksjoner til nøkkelaktørene involvert i vesikkeltransport, -rekruttering og -festing. For dette tilpasset vi nylig etablerte molekylærbiologiske teknikker, inkludert transient transfeksjon og CRISPR/Cas9-mediert genomredigering. Vi brukte volum-elektronmikroskopi og 3D-organelle-rekonstruksjon for å beskrive knockout-fenotyper. Proteinet Unc13 er et vesikkelfestings- og rekrutteringsprotein i metazoiske regulerte sekretoriske celler, slik som mastceller, nøytrofiler, insulinutskillende beta-celler i bukspyttkjertelen, og i kjemiske pre-synaptiske nevroner. De viktigste proteindomenene som fremhever metazoisk homolog av dette proteinet er bevart i choanoflagellater, og her viser vi at dette proteinet fungerer i apikal vesikkelrekruttering og -fusjon. Knockout av SrUnc13-1 viser defekter i flagelldannelse og celledeling. SPIRE er et aktin nukleatorprotein som, i metazoer, muliggjør aktinnukleering for apikal transport av vesikler via interaksjonen med Myosin-5 (MYO5) motorprotein og Rab3 vesikkelmarkørprotein. Transient transfeksjon av S. rosetta homologer SrSPIRE, SrMYO5 og SrRab8 (stamfarprotein til metazoisk-spesifikk Rab3) avslører apikal lokalisering av deres respektive punkter. Denne avhandlingen fremhever den bevarte reguleringen i apikal vesikkeltransport, -rekruttering og -fusjon i metazoer og choanoflagellater. Regulert sekresjon slik vi ser den i komplekse metazoiske celletyper dateres minst tilbaketil den siste felles stamfaren til choanoflagellater og metazoer.

The evolution of tightly regulated secretion, such as in neurons, marked a turning point for the origins and diversification of cell types in the animal kingdom. Specialized regulated secretory cells are employed in key organismal processes and pathways, such as in immunity and defense, metabolism and growth, and information processing. However, the evolutionary origin of regulated secretion is largely unknown. In this thesis, we used choanoflagellates – the sister group of metazoans – to describe the localization and potential functions of the key players involved in vesicle transport, recruitment, and tethering. For this, we adopted recently established techniques, including transient transfection and CRISPR/Cas9-mediated genome editing. We used volume electron microscopy and 3D organelle reconstruction to describe knockout phenotypes. Protein Uncoordinated-13 (Unc13) is a vesicle tethering and recruitment protein in metazoan-regulated secretory cells, such as the mast cells, neutrophils, insulin-secreting pancreatic beta-cells, and in chemical pre-synapses in neurons. The major domains that highlight the metazoan homolog of this protein are conserved in choanoflagellates, and here we show that this protein functions in apical vesicle recruitment and fusion. Knocking out SrUnc13-1 shows defects in flagellum formation and cell division. Protein SPIRE homolog (in short, SPIRE), is an actin nucleator protein that, in metazoans, enables actin nucleation for apical transport of vesicles via the interaction with Myosin-5 (MYO5) motor protein and Rab3 vesicle marker protein. Transient transfection of S. rosetta homologs SrSPIRE, SrMYO5, and SrRab8 (ancestral protein of metazoan-specific Rab3) reveals apical localization of their respective punctae. Overall, this thesis highlights the conserved regulation in apical vesicle transport, recruitment, and fusion in metazoans and choanoflagellates.