Novel tools to investigate Arc protein molecular function in synaptic plasticity

Abstract

Synaptisk plastisitet er en korrelasjon for læring og hukommelse i det mammale hjernen, som produserer endringer på et synaptisk nivå i det nevrale nettverket, som kan være av kortvarig eller langvarig art. For langvarige synaptiske endringer er genuttrykk essensielt. Et primært eksempel er uttrykket av umiddelbare tidlige gener (IEG) koblet til nevronal aktivitet. Aktivitetsregulert cytoskjelett-assosiert protein, også kjent som Arc, er et proteinprodukt av et IEG og har vist seg å være et nøkkelprotein for forskjellige former for synaptisk plastisitet, som langvarig depresjon eller potensiering, samt homeostatisk skalering. Selv om det er velkjent at Arcproteinet spiller en viktig rolle i disse prosessene, er det fortsatt ukjent hvordan det veksler mellom tilsynelatende motstridende mekanismer. I denne avhandlingen ønsker jeg å fremheve to aspekter ved Arc-proteinet som kan forklare dets molekylære skifte mellom forskjellige former for synaptisk plastisitet: For det første er Arc i stand til selvassosiasjon i forskjellige oligomeriske tilstander, noe som kan påvirke strukturen og dermed funksjonen; og for det andre kan Arc binde seg til forskjellige synaptiske effektorproteiner, spesielt via sitt hydrofobe bindingslomme til stede i N-loben av sin C-terminale domene, noe som kan diktere hvilken prosess Arc deltar i. Ved å kombinere de nevnte aspektene er det også mulig at Arcs oligomeriske tilstand dikterer hvilke proteiner det binder seg til, og dermed påvirker målet og funksjonen i synaptisk plastisitet. I denne avhandlingen søkte jeg å utvikle nye verktøy for å oppdage og undersøke Arcs selvassosiasjon og undersøke virkningen av Arcs N-lobepåvirkning i synaptisk overføring.

Først utviklet og validerte vi de første anti-Arc-nanobodyene for å gi et nytt verktøysett for å undersøke Arc-proteinets funksjon og dynamikk. Vi har vist deres evne til å oppdage ektopisk og endogent Arc-protein via biokjemiske analyser i forskjellige typer prøver, fra cellelinjer til rottehjernvev. Via epitopkartlegging har vi karakterisert bindingsstedet for hver av nanobodyene. Dette ble etterfulgt av demonstrasjon av deres bruk som intrabodies, vist ved immunopresipitasjon av Arc-protein og dets underregioner. Disse nanobodyene karakteriserer et nytt verktøy for å undersøke Arcs funksjon og dynamikk, som for eksempel dens evne til selvassosiasjon.

Ved hjelp av dette nylig utviklede verktøysettet, i den andre delen av dette arbeidet, brukte vi to av disse nanobodyene (H11 og C11) for å oppdage Arcs selvassosiasjon via en nærhetsligasjonsanalyse (PLA) i nevronale hippocampale primærkulturer. For å utvikle dette modifiserte vi PLA-metoden, som er i stand til å oppdage protein-proteinnærhet, ved å legge til et ekstra trinn med et par nanobodyer, konjugert med to forskjellige merker, ALFA og FLAG. Ved å kombinere disse har vi validert, ved hjelp av en annen serie kontrollforsøk, at vi kan oppdage endogene Arc-Arc-komplekser in situ i nevronkultur og HEK293FT-celler. Etter valideringen viste vi at disse kompleksene ikke ble påvirket av hemming av nylig nevronal aktivitet og de novo proteinuttrykk. For å bedre forstå de detekterte Arc-Arc-kompleksene og deres oligomeriske tilstand, blokkerte vi Arc-oligomerisering ved hjelp av en designet TATpenetrerende peptid (OligoOFF), som inneholder Arcs oligomotivsekvens (a.a. 113- 119). OligoOFF-peptidet reduserte kompleksene som ble detektert ved bruk av H11- par, noe som indikerer en deteksjon som er følsom for Arc-oligomerer. Etter disse resultatene brukte vi Arc-Arc-PLA for å verifisere responsen til disse kompleksene på kjemikalier som er kjent for å indusere Arc-uttrykk, først med hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF). Overraskende nok førte BDNF til en reduksjon i kompleksene som ble detektert ved PLA, i motsetning til økningen som ble detektert via vanlig immunofarging. For å sjekke reproduksjonen av disse resultatene brukte vi et nytt nanobody-par, C11, som binder seg til en annen region i Arc-proteinet. I motsetning til H11-resultatene, detekterte C11-paret en økning i disse kompleksene, noe som indikerer at de to klonene kan oppdage forskjellige oligomerer av selvassosiert Arc. For å forstå disse motstridende resultatene brukte vi også OligoOFF-peptidet med C11 for deteksjon, noe som ikke forårsaket noen endringer i Arc-Arc-kompleksene som ble detektert av C11-paret. I tillegg til BDNF brukte vi DHPG, som er kjent for å indusere Arc-uttrykk og har blitt korrelert med høyere oligomerisk tilstand. DHPG induserte en økning i kompleksene som bare ble detektert av H11. Basert på disse funnene og nåværende kunnskap om Arc-oligomerisering, antar vi at PLA-signalet som detekteres av H11, foretrekker å oppdage høyordens oligomerer, mens C11 detekterer dimerisk Arc, og at disse formene påvirkes forskjellig av de kjemiske stimuliene som brukes i dette arbeidet.

I tillegg til Arcs selvassosiasjon/oligomerisering, presenterer Arcs N-lobe og dets bindingspartnere en annen måte å forstå skiftet av Arc-proteinet mellom forskjellige mekanismer for plastisitet. Ved å rette fokus mot dette aspektet av Arc, søker vi å utvikle et annet verktøy for å gi grunnlag for bedre forståelse av Arcs N-lobe-funksjon i dens aktivitetsmodulering. Derfor har vi validert adeno-assosiert virus (AAV)- konstruksjoner som inneholder Arcs N-lobe for å undersøke dens overuttrykkseffekt i granulacellene i den dentate gyrus i hippocampus hos voksne rotter. Uttrykket for disse vektorene var koblet til to forskjellige promotorer: synapsin I, en generell nevronal promoter, og CamKII, som er aktiv i voksne eksitatoriske nevroner. Først viste vi deteksjonen av det overuttrykte N-lobe på infeksjonsstedet i hippocampus via biokjemi og immunofarging ved hjelp av FLAG-merket Arc-nanobody H11. Etter dette viste elektrofysiologiske opptak rettet mot den mediale perforante banen til den dentate gyrus en generell økning i den synaptiske effektiviteten til granulacellene for N-lobe uttrykt av begge promotorene. Imidlertid var økningen i eksitabiliteten til disse cellene avhengig av CamKII-promotorekspressjon. I tillegg til WT N-lobe har vi uttrykt en mutert versjon av det (P217F), som retter seg mot en aminosyre som tidligere er identifisert in vitro som kritisk for bindingen av Arcs N-lobe til Stargazin. Denne bindingen har også blitt relatert til AMPA-reseptorendocytose, noe som kan være relatert til effekten som ble observert ved overuttrykk av N-lobe på synaptisk effektivitet. For å bekrefte betydningen av den kritiske aminosyren, førte mutasjonen av P217F til at effektene som ble observert ved overuttrykk av WT N-lobe, ble opphevet.

Ved å kombinere resultatene nevnt ovenfor, presenterer denne avhandlingen to nye verktøy for å avdekke mer om Arc-proteinets funksjon og hvordan det veksler mellom forskjellige mekanismer for synaptisk plastisitet. Med nanobodyene presenterer vi et verktøysett for å oppdage, visualisere og undersøke Arcs funksjon, med fokus på selvassosiasjon. Med AAV-konstruksjonene viser vi en ny modell for å studere Arcs N-lobe-funksjon og hvordan overuttrykk påvirker elektrofysiologien til den mediale perforante banen til den dentate gyrus i hippocampus hos voksne rotter.

Synaptic plasticity is a correlate for learning and memory in the mammalian brain, producing changes at a synaptic level in the neuronal network, that could be of short or long-lasting in nature. For long-term synaptic changes, gene expression is essential. A primary example is expression of immediate early genes (IEG’s) coupled to neuronal activity. Activity-regulated cytoskeleton-associated protein or Arc is a protein product of an IEG and has been shown to be a key protein for different forms of synaptic plasticity, such as long-term depression or potentiation, and homeostatic scaling. Although it is well known that Arc protein plays an important role in those processes, it is still unknown how it alternates between seemly opposing mechanisms. In this thesis I would like to highlight two aspects about Arc protein that might explain its molecular switch between different forms of synaptic plasticity: first, Arc is capable of self-associating into different oligomeric states, which might affect its structure and consequently its function; and second, Arc can bind to different synaptic effector proteins, particularly via its hydrophobic binding pocket present in the N-lobe of its Cterminal domain, which may dictate which process Arc participates on. Combining the aspects presented above, it is also possible that Arc oligomeric state dictates which proteins it binds to, consequently affecting its target and function in synaptic plasticity. In this thesis, I sought to develop new tools to detect and probe Arc self-association and investigate the impact of Arc N-lobe impact in synaptic transmission.

First, we developed and validated the first anti-Arc nanobodies to provide a new toolset to investigate Arc protein function and dynamics. We have shown their capacity for detecting ectopic and endogenous Arc protein via biochemical assays in different types of samples, ranging from cell lines to rat brain tissue. Via epitope mapping, we have characterized the binding site for each of the nanobodies. That was followed by demonstrating its use as intrabodies, shown by immunoprecipitation in Arc protein and its subregions. These nanobodies characterize a new toolbox for investigating Arc function and its dynamics, such as its capacity to self-associate.

Using this newly developed toolbox, in the second section of this work, we applied two of these nanobodies (H11 and C11) for the detection of Arc self-association via proximity ligation assay (PLA) in neuronal hippocampal primary culture. To develop that, we modified the PLA, a method capable of detecting protein-protein proximity, adding an additional step with a pair of nanobodies, conjugated with two different tags, ALFA and FLAG. Combining those, we have validated with a different set of control experiments, using neuronal culture and HEK293FT cells, that we can detect endogenous Arc-Arc complexes in situ. Following the validation, after exposing the neurons tetrodotoxin and cycloheximide, we have shown that these complexes were not affected by inhibition of recent neuronal activity and de novo protein expression. To better understand the Arc-Arc complexes detected and its oligomeric state, we blocked Arc oligomerization using a designed TAT penetrating peptide (OligoOFF), containing Arc oligo motif sequence (a.a. 113-119). The OligoOFF peptide reduced the complexes detected using H11 pair, indicating a detection sensitive to Arc oligomers. Following those results, we used Arc-Arc PLA to verify the response of those complexes to chemicals known to induce Arc expression, starting with brainderived neurotrophic factor (BDNF). Surprisingly, BDNF caused a reduction of the complexes detected by PLA, in contrast to its increase detected via regular immunostaining. To check for the reproducibility of these results, we used a new nanobody pair, C11, that binds to a different region in Arc protein. Opposing to H11 results, C11 pair detected an increase of those complexes, indicating that the two clones might be detecting different oligomers of self-associated Arc. To understand these opposing results, we also used the OligoOFF peptide using C11 for the detection, which did not cause any changes in the Arc-Arc complexes detected by C11 pair. In addition to BDNF, we used DHPG, known to induce Arc expression and has been correlated to its higher oligomeric state. DHPG induced an increase in the complexes detected only by H11. Based on these findings and current knowledge of Arc oligomerization, we hypothesize that PLA signal detected by H11 preferentially detect high-order oligomers while C11 detects dimeric Arc, and that those forms are differently affected by the chemical stimuli used in this work.

Besides Arc self-association/oligomerization, Arc N-lobe and its binding partners present another way to understand the shift of Arc protein between different mechanisms of plasticity. Targeting that aspect of Arc, we seek to develop another tool to provide grounds to better understand Arc N-lobe function in its activity modulation. Thus, we have validated adeno-associated virus (AAV) constructs containing Arc Nlobe to investigate its overexpression impact in the granule cells of the dentate gyrus in the hippocampus of adult rats. The expression of those vectors was coupled to two different promoters, synapsin I, a general neuronal promoter, and CamKII, which is active in adult excitatory neurons. First, we have shown the detection of the overexpressed N-lobe in the infected site in the hippocampus via biochemistry and immunostaining using FLAG-tagged Arc nanobody H11. Following that, electrophysiology recordings targeting the medial perforant path to the dentate gyrus have shown an overall increase in the synaptic efficacy of the granule cells for N-lobe expressed by both promoters. However, the increase in the excitability of these cells by N-lobe was dependent on CamKII promoter expression. In addition to the WT Nlobe, we have expressed a mutant version of it (P217F), targeting an amino acid residue that has been previously identified in vitro to be critical to the binding of Arc N-lobe to Stargazin. This binding has also been related to AMPA receptor endocytosis, which might be related to the impact observed by N-lobe overexpression over synaptic efficacy. Confirming the importance of the critical amino acid residue, the mutation of P217F abolished the effects observed by the overexpression of WT N-lobe.

Combining the results mentioned above, this thesis presents two new tools to unravel more about Arc protein function and its switching between different mechanisms of synaptic plasticity. With the nanobodies we present a toolbox to detect, visualize and investigate Arc function, highlighting here its self-association. With the AAV constructs, we show a new model to study Arc N-lobe function and how its overexpression affects the electrophysiology of the medial perforant path to the dentate gyrus in the hippocampus of adult rats.