Paraneoplastic cerebellar degeneration: Exploring the roles of the cerebellar degeneration-related proteins and exosomal microRNAs

Abstract

Bakgrunn: Paraneoplastisk cerebellær degenerasjon (PCD) er eit av dei vanlegaste paraneoplastiske nevrologiske syndroma - ei gruppe sjeldne, immunmedierte syndrom assosiert med kreft. Individ med PCD har autoantistoff i både serum og cerebrospinalvæske. Det vanlegaste av desse autoantistoffa er anti-Yo som først og fremst vert funne hos pasientar med eggstokk- og brystkreft. Anti-Yo bind seg til ei gruppe protein kalla cerebellær degenerasjonsrelaterte (CDR) protein som er uttrykt av kreftceller og Purkinjeceller. Dei biologiske funksjonane til CDR proteina er dårleg forstått. Om desse proteina bidrar til patogenesen i PCD er derfor ikkje kjend.

Mikro-RNA er ikkje-kodande RNA-molekyl som regulerer genuttrykk i celler. Dei finst også i små ekstracellulære vesiklar kalla eksosom som overfører mikro-RNA mellom celler. Oppkonsentrasjon av spesifikke mikro-RNA i eksosom har blitt funne i fleire patologiske tilstandar inkludert kreft og nevrodegenerative sjukdommar.

Mål: Målet med dette arbeidet var å utforske dei biologiske eigenskapane til CDR proteina gjennom knock-out eksperiment og påfølgande protein- og genekspresjonsanalyse. I tillegg undersøkte vi om PCD er assosiert med endringar i dei eksosomale mikro-RNA-profilane til pasientar med eggstokkreft.

Material og metodar: I artikkel I og artikkel II vart RNA-sekvensering og massespektrometribasert proteomikk nytta for å vurdere endringar i transkriptomet, proteomet og sekretomet til CDR1-, CDR2- og CDR2L-knock-out-celler. Differensiell ekspresjonsanalyse, gensettanrikingsanalyse og protein-protein-interaksjonsnettverk vart nytta for å identifisere biologiske prosessar påverka av knock-out eksperimenta. I artikkel III vart eksosom isolert frå serumet til eggstokkreftpasientar med og utan anti-Yo-assosiert PCD og frå friske kontrollar. RNA-sekvensering vart utført for å karakterisere det eksosomale mikro-RNA-uttrykket. «Receiver operating characteristic curves» vart nytta til å vurdere om mikro-RNA signaturar differensierer mellom eggstokkreftpasientar med og utan PCD. Mikro-RNA-målprediksjonsanalyse vart nytta for å identifisere genmåla til differensielt uttrykte mikro-RNA.

Resultat: Knock-out av CDR2L forårsaka dysregulering av gen assosiert med ribosom, proteinsyntese og cellesyklusprogresjon, noko som leia til nedsett celleproliferasjon. Knockout av CDR1 førte til endra uttrykk av gen assosiert med celle-celleadhesjon og celle-matrix adhesjon. Dette resulterte i nedsett cellemigrasjon. Eksosomal mikro-RNA-profilering viste at pasientar med eggstokkreft og PCD hadde ein distinkt eksosomal mikro-RNA-profil samanlikna med både eggstokkreftpasienter utan PCD og friske kontrollar. Fleire av dei differensielt uttrykte mikro-RNA-a har diagnostisk potensial ved å identifisere pasientane med PCD, og vart funnen å kunne binde til CDR2L.

Konklusjonar: Våre funn støttar oppunder hypotesen om at CDR2L er involvert i ribosomal funksjon. Knock-out av CDR1 endrar uttrykket av celleadhesjonsmolekyl som påverkar cellemigrasjon i eggstokkreftceller. Dette arbeidet viser, for første gong, at PCD endrar den eksosomale mikro-RNA profilen til eggstokkreftpasientar, noko som kan være relevant for vår forståing av patogenesen til PCD.

Background: Paraneoplastic cerebellar degeneration (PCD) is one of the most common forms of paraneoplastic neurological syndromes – a group of rare, immune-mediated disorders associated with cancer. Individuals with PCD have autoantibodies in both serum and cerebrospinal fluid. The most common of these autoantibodies is anti-Yo, which is primarily found in patients with ovarian and breast cancer. Anti-Yo targets a group of proteins known as the cerebellar degeneration-related (CDR) proteins that are expressed by cancer cells and Purkinje cells. The biological functions of the CDR proteins are poorly understood. Whether these proteins contribute to PCD pathogenesis is therefore not known.

MicroRNAs are non-coding RNA molecules that regulate gene expression in cells. They are also found in small extracellular vesicles known as exosomes that transfer microRNAs between cells. Enrichment of specific microRNAs in exosomes is found in several pathological conditions including cancer and neurodegenerative diseases.

Aims: This work aimed to explore the biological properties of the CDR proteins through knockout experiments and subsequent gene and protein expression analysis. Additionally, we investigated whether PCD is associated with changes in the exosomal microRNA profiles of ovarian cancer patients.

Materials and methods: In paper I and paper II, RNA sequencing and mass spectrometry-based proteomics were used to assess changes to the transcriptome, proteome and secretome of CDR1-, CDR2-, and CDR2L-knockout cells. Differential expression analysis, gene set enrichment analysis, and protein-protein interaction networks were used to identify biological processes affected by the knockouts. In paper III, exosomes were isolated from the sera of ovarian cancer patients with and without anti-Yo-associated PCD and from healthy controls. Small RNA sequencing was performed to characterize the exosomal microRNA expression. Receiver operating curves were used to assess whether microRNA signatures differentiated between ovarian cancer patients with and without PCD. MicroRNA target prediction analysis was used to identify the gene targets of the differentially expressed microRNAs.

Results: Knockout of CDR2L caused dysregulation of genes associated with ribosomes, protein translation, and cell cycle progression, ultimately causing impaired cell proliferation. Knockout of CDR1, on the other hand, led to altered expression of genes associated with cell-cell adhesion and cell-matrix adhesion, which in turn suppressed cell migration. Exosomal microRNA profiling revealed that ovarian cancer patients with PCD had a distinct exosomal microRNA profile compared to both ovarian cancer patients without PCD and healthy controls. Several of the differentially expressed microRNAs have diagnostic potential in distinguishing patients with PCD and were found to target CDR2L.

Conclusions: Our findings provide evidence supporting the hypothesis that CDR2L is involved in ribosomal function. Knockout of CDR1 alters the expression of cell adhesion molecules that influence migration of ovarian cancer cells. This work demonstrates, for the first time, that PCD alters the exosomal microRNA profiles of ovarian cancer patients, which may be relevant for understanding the pathogenesis of PCD.