Exploring FabF as a new target for antibiotic-resistant Pseudomonas aeruginosa: Assay development, fragment screening and hit optimization

Abstract

Oppdagelsen av antibiotika er utvilsomt blant de største triumfene innen moderne medisin, og har i stor grad forbedret sykdomsforløpet ved de fleste vanlige bakterieinfeksjoner. I dag har triumffanfarene blitt modulert til en kakofoni av alarmklokker, ettersom virkningen av disse legemidlene avtar, og den tidligere synkende dødeligheten øker. De globale dødsfallene i 2019 tilskrevet antibiotikaresistens ble estimert til 1,27 millioner, mer enn malaria og HIV til sammen, noe som gjør det til en av de alvorligste helsetruslene i dag. Et særlig bekymringsverdig patogen er karbapenem-resistent P. aeruginosa, en svært tilpasningsdyktig gram-negativ bakterie, som WHO har erklært et akutt behov for nye antibiotika mot.

Vi fokuserte derfor vårt arbeide på målvalidering og tidlig-fase legemiddeloppdagelse mot β-ketoacyl-ACP-syntaser, enzymer som antas å være essensielle for P. aeruginosa fettsyresyntese. Flere fragment-screeninger mot type II-varianten (FabF) ved bruk av virtuell screening, bio-layer interferometri (BLI) og massespektrometri samt den påfølgende valideringen fra disse og andre screeninger er beskrevet. Hit-forbindelsene ble optimalisert ved bruk av katalogbasert SAR, rasjonelt design, virtuell screening av det store kombinasjonelle Enamine REAL kjemiske rommet, samt empirisk screening av fokuserte biblioteker, noe som resulterte i den mest potente forbindelsen med en KD på 19 μM.

Videre rapporteres syntese og in vitro-evaluering av to serier av kovalente hemmere avledet fra ikke-kovalente hits. Generelt ga de ikke-kovalente binderne funnet ved bruk av empiriske metoder de høyeste affinitetene. Forbindelser fra virtuell screening ga co-krystallstrukturer, noe som bekreftet at noen av dem bandt med den tiltenkte bindingsmodusen. Imidlertid ga ligandene bare lave signaler ved bruk av den utviklede BLI-metoden og bør valideres ved bruk av en mer sensitiv metode. Videre merket ikke den syntetiserte serien av forbindelser med elektrofile warheads FabF, muligens på grunn av at cysteinet i det aktive setet ikke kunne orientere seg på den nødvendige måten.

Til slutt indikerte vår målvalidering av P. aeruginosa β-ketoacyl-ACP-syntaser ved bruk av potente naturstoffer at disse målene kan være vanskeligere å hemme i en klinisk relevant P. aeruginosa-stamme sammenlignet med andre gram-negative bakterier, i kontrast til tidligere funn.

Samlet sett danner avhandlingen et omfattende grunnlag for videreutvikling av antibiotika som retter seg mot fettsyresyntesesyklusen til P. aeruginosa og andre patogener.

The discovery of antibiotics is evidently among the greatest triumphs of modern medicine, vastly improving the chances of recovery from most common bacterial infections. Today, the fanfares of triumph have modulated into a cacophony of alarm bells, as the efficacy of these drugs are diminishing, and the once dwindling mortality is rising. The global deaths in 2019 attributed to antimicrobial resistance was estimated to be 1.27 million, more than malaria and HIV combined, putting it among the currently gravest threats to public health. A pathogen of particular concern is carbapenem-resistant P. aeruginosa, a highly adaptive Gram-negative bacteria, for which the WHO has declared an urgent need for new antibiotics.

We therefore focused our efforts on target validation and early-stage drug-discovery of β-ketoacyl-ACP-synthases, enzymes believed to be essential for P. aeruginosa fatty acid synthesis. Several fragment screening campaigns against the type II variant (FabF) using virtual screening, bio-layer interferometry (BLI) and mass spectrometry or the subsequent hit-validation from these and other screens are described. The hits were optimized using SAR-by-catalogue, rational design, virtual screening of the large combinatorial Enamine REAL space and empirical screening of focused libraries, resulting in the most potent compound binding with a KD of 19 μM.

Further, the synthesis and in vitro evaluation of two series of covalent inhibitors derived from non-covalent binding hits is reported. Generally, the non-covalent binders found using empirical methods gave the highest affinities. With compounds from virtual screening co-crystal structures could be obtained, confirming that some of them bound with the intended pose. However, the ligands only produced low signals in the developed BLI assay and should be validated using a more sensitive method. Moreover, the synthesized series of compounds carrying an electrophilic warhead did not label FabF, perhaps due to the cysteine not being able to orient itself appropriately for an attack to occur.

Finally, our target validation of P. aeruginosa β-ketoacyl-ACP-synthases using potent natural products indicated that these targets might be more difficult to inhibit in a clinically relevant P. aeruginosa strain compared to other Gram-negative bacteria, contrary to earlier reports.

Collectively, the reported data forms a comprehensive foundation to inform development of antibiotic lead compounds targeting the fatty acid synthesis cycle of P. aeruginosa and other pathogens.