Simulating Life at the Periphery: Mechanisms of Membrane Binding and Cargo Extraction by Lipid Transfer Proteins

Abstract

Biologiske membraner er svært sofistikerte strukturer som består av tusenvis av forskjellige lipidtyper. Deres mekaniske egenskaper bestemmes hovedsakelig av lipidkomposisjonen, noe som gjør det avgjørende for celler å regulere sine lipidprofiler på en konsekvent måte. En viktig mekanisme for å opprettholde korrekt lipidkomposisjon er ikke-vesikulær overføring av individuelle lipider mellom membraner, tilrettelagt av lipidtransferproteiner. Selv om denne prosessen er biologisk betydningsfull, er de molekylære detaljene fortsatt ikke godt forstått. I denne avhandlingen fremmer vi vår biofysiske forståelse av ikke-vesikulære lipidoverføringsmekanismer ved å undersøke interaksjonene mellom lipidoverføringsproteiner og membraner gjennom en kombinasjon av molekylære dynamikksimuleringer, frienergiberegninger og eksperimentelle valideringer. START-domener er konserverte proteinstrukturer i menneskeceller som er ansvarlige for ikke-vesikulær lipidoverføring mellom intracellulære membraner. De fleste START-domener fungerer ved membranoverflaten og selektivt ekstraherer eller frigir lipider. For å forstå de molekylære mekanismene bak START-domenenes funksjon, er det nødvendig å avklare hendelsene ved grenseflaten mellom membran og protein. For dette formålet valgte vi STARD2- og STARD4-proteinene, som henholdsvis er fosfatidylkolin- og kolesteroltransferproteiner. Vi gjennomførte først mikrosekund-lange likevektssimuleringer med MD for å studere membranbindingen til disse domenene på ulike membranmodeller, med mål om å identifisere potensielle mekanismer for membranspesifisitet. Simuleringsresultatene indikerer at STARD4 foretrekker å binde seg til PIP2-inneholdende dobbeltlag. Tilstedeværelsen av last ser ut til å redusere STARD4’s lipidspesifisitet ved å indusere lokale konformasjonsendringer, noe som potensielt fungerer som en regulatorisk mekanisme for membranselektivitet. Dette kompenserer for fraværet av tilleggsdomener som ofte brukes av andre lipidoverføringsproteiner for lokalisering og regulering. Derimot ble det ikke observert noen membranselektivitet for STARD2-proteinet. Til tross for deres lignende strukturer, viser START-domener ulike dynamikker som påvirker deres membranbindingsatferd. Deretter utforsket vi mekanismene for lipidopptak og -frigivelse av STARD2-proteinet. Vi foreslår en modellmekanisme som beskriver hvordan STARD2 ekstraherer fosfatidylkolinlipider fra membraner. Denne prosessen involverer metastabile mellomtilstander som stabiliseres av kation-π-interaksjoner mellom kolinhodegruppen til fosfatidylkolin og konserverte tyrosin- og tryptofanrester. FEP indikerer at disse interaksjonene betydelig reduserer energibarrieren for desorpsjon av et POPC-lipid fra membranen. I den siste delen av denne avhandlingen undersøkte vi protein-membran-interaksjoner fra et termodynamisk perspektiv ved bruk av geometriske frienergiberegninger. Å bestemme den bindingsfrie energien til proteiner til membraner er spesielt utfordrende på grunn av faktorer som langsom lateral lipiddiffusjon og betydelig rotasjons-, posisjons- og konformasjonsentropi involvert i assosiasjons- og dissosiasjonsprosessene. For å møte disse utfordringene benyttet vi WTM-eABF-metoden for å evaluere dens effektivitet i å måle effekten av endringer i lipidkomposisjonen på den absolutte protein-membran bindingsfrie energien. Resultatene stemmer overens med eksperimentelle trender, selv om de overvurderer bindingsfrie energien noe. Studiene som presenteres i denne avhandlingen, forbedrer vår biofysiske forståelse av lipidtransport og protein-membran-interaksjoner betydelig. Innsikt i de molekylære mekanismene til individuelle lipidtransferproteiner vil bidra til vår forståelse av hvordan disse proteinene samarbeider for å regulere cellemembransammensetningen på en koordinert måte.

Biological membranes are highly sophisticated structures consisting of thousands of different lipid types. Their mechanical properties are primarily dictated by lipid composition, making it crucial for cells to regulate their lipid profiles consistently. One key mechanism for maintaining correct lipid composition is the non-vesicular transfer of individual lipids between membranes, facilitated by lipid transfer proteins. Although this process is biologically significant, its molecular details remain poorly understood. In this thesis, we advance our biophysical understanding of non-vesicular lipid transfer mechanisms by investigating the interactions between lipid transfer proteins and membranes through a combination of molecular dynamics simulations, free energy calculations, and experimental validations. START domains are conserved protein structures in human cells responsible for non-vesicular lipid transfer between intracellular membranes. Most START domains function at the membrane surface, selectively extracting or releasing lipids. Understanding the molecular mechanisms of START domain function requires elucidating the events at the membrane interface. For this purpose, we selected the STARD2 and the STARD4 proteins, which are phosphatidylcholine and cholesterol transfer proteins, respectively. We first conducted microsecond-long equilibrium MD simulations to study the membrane binding of these domains to different membrane models, aiming to identify potential mechanisms of membrane specificity. Simulation results indicate that STARD4 preferentially binds to PIP2-containing bilayers. The presence of cargo appears to reduce the lipid specificity of STARD4 by inducing local conformational changes, potentially serving as a regulatory mechanism for membrane selectivity. This compensates for the absence of additional domains often used by other lipid transfer proteins for localization and regulation. In contrast, no membrane selectivity was observed for the STARD2 protein. Despite their similar structures, START domains exhibit different dynamics that affect their membrane binding behavior. Next, we explored the lipid uptake and release mechanisms of the STARD2 protein. We propose a model mechanism describing how STARD2 extracts phosphatidylcholine lipids from membranes. This process involves metastable intermediate states stabilized by cation-π interactions between the choline headgroup of phosphatidylcholine and conserved tyrosine and tryptophan residues. FEP calculations indicate that these interactions significantly lower the energy barrier for desorbing a POPC lipid from the membrane. In the final part of this thesis, we examined protein-membrane interactions from a thermodynamic perspective using free energy calculations along a geometrical route. Determining the binding free energy of proteins to membranes is particularly challenging due to factors such as slow lateral lipid diffusion and the significant rotational, positional, and conformational entropies involved in the association and dissociation processes. To address these challenges, we employed the WTM-eABF method to assess its effectiveness in measuring the impact of lipid composition changes on the absolute protein-membrane binding free energy. The results align with experimental trends, although they slightly overestimate the binding free energy. The studies presented in this thesis significantly enhance our biophysical understanding of lipid transport and protein-membrane interactions. Insights into the molecular mechanisms of individual lipid transfer proteins will contribute to our understanding of how these proteins work in concert to regulate cell membrane composition in a coordinated manner.