The protistan parasite Marteilia pararefringens (Paramyxida) in bivalves and its distribution along the Norwegian coast

Abstract

I Norge har man overvåket for parasittsykdommen marteiliose, forårsaket av Marteilia refringens, siden 1995 i flatøsters Ostrea edulis og 2010 i blåskjell Mytilus spp. Veterinærinstituttet hadde ansvaret for overvåkningsprogrammet fra 1995 til 2015, da ansvaret for å overvåke bestandene ble tatt over av Havforskningsinstituttet. Parasitten var ikke påvist før den ble oppdaget i blåskjell i en nedlagt østerspoll, Agapollen, på Bømlo i Vestland fylke. Blåskjellene var sterkt infisert av parasitten, da identifisert som M. refringens Type M, mens flatøstersen fra samme lokalitet ikke har vist tegn til sykdom. M. refringens Type M har siden endret navn til Marteilia pararefringens. I forbindelse med det overraskende funnet, ble det oppdaget at Marteilia sp. hadde blitt rapportert tidligere som del av en forurensingsstudie i Haugesundsområdet i 2006-2007. Dette funnet ble ikke rapportert til Mattilsynet men viste at parasitten har vært til stede i norske skjell i en årrekke uten å bli oppdaget av overvåkningsprogrammet. Funnene avdekket et behov for mer kunnskap rundt parasittens utbredelse og vertsspesifisitet.

For å kunne kartlegge parasittens utbredelse, måtte man først undersøke om livssyklusen til M. pararefringens kan fullføres i pollsystemet. Naive blåskjell, som aldri har vært utsatt for parasitten, ble satt ut i Agapollen og regelmessig prøvetatt. M. pararefringens smitter blåskjellene tidlig om sommeren når temperaturen i pollen øker. Parasitten kan utvikle seg raskt, fra kun PCR deteksjon til kraftig infeksjon med sporolerende stadier i løpet av tre uker. Sporolerende stadier er til stede om høsten og kan ligge i dvale frem til påfølgende vår når temperaturen øker igjen.

Man finner tre blåskjellarter spredt langs norskekysten: Mytilus edulis, M. galloprovincialis, og M. trossulus, samt hybrider mellom dem. Vertsreaksjonen i blåskjellene varierer mellom individer utsatt for samme smittepress. Dette skyldes sannsynligvis en genetisk forskjell, men vi kunne ikke konkludere at det var en sammenheng mellom blåskjellart og grad av vertsrespons i smittede blåskjell. Vi fant, for første gang, marteiliose forårsaket av M. pararefringens i M. trossulus. Disse blåskjellene var kraftig infisert. Videre fant vi at alle størrelser av blåskjell, fra nylig bunnslått yngel til store (>100 mm) individer, kan bli smittet av parasitten.

M. pararefringens har en større utbredelse enn tidligere antatt. Blåskjellprøver ble tatt fra 11 ynglepoller (eller lignende miljø), 17 fedepoller (eller lignende miljø) og åtte små terskelfjorder og beskyttede bukter langs kysten, fra Risør til Tromsø. Blåskjellene ble først undersøkt med Marteilia-spesifikk PCR før positive resultater ble bekreftet med histologi. Parasitten har spredte forekomster langs kysten, hvor fem ynglepoller og to terskelfjorder hadde positive blåskjell. Parasitten var lokalisert i tre områder: Fjaler/Solund, Bømlo/Tysnes og utenfor Kristiansand. Parasittens utbredelse ser ikke ut til å være koblet til tidligere østersproduksjon i pollene og den har ikke spredt seg til nærliggende lokaliteter via havstrøm. Vi har ikke funnet M. pararefringens i Tysværvågen eller Høgevarden der det ble rapportert om høy prevalens i blåskjell i 2006-2007. Funnene våre tyder på at parasitten kan forsvinne eller at den krever spesifikke miljøbetingelser som ikke alltid er oppfylt i de andre negative lokalitetene. Videre forskning kreves for å avdekke andre mulige reservoarer utenfor blåskjellene.

M. pararefringens trenger en eller flere mellomverter for å kunne smitte mellom blåskjell. Arter innen dyreplankton er de mest aktuelle kandidatene i livssyklusen. Prøver av dyreplankton ble tatt på to meters dyp fra 30 lokaliteter hvor parasittens tilstedeværelse i blåskjell er kjent. Av de syv lokalitetene med positive blåskjell, var det kun to som hadde PCR positive dyreplankton: Agapollen og Pollevik. Prøver av dyreplankton fra Agapollen, tatt annenhver uke, har vist at Marteilia sp. er til stede to ganger: først i juni/tidlig juli, og sist i slutten av august til slutten av september. I november var dyreplankton og Marteilia sp. borte fra pollvannet.

Dyreplankton ble sortert under stereomikroskop til laveste taksonomisk gruppe som kunne bli identifisert, og analysert med Marteilia-spesifikk PCR. Metabarcoding ble brukt for å beskrive kryptiske arter (f.eks Acartia spp.) og sammenligne med tradisjonell artsbestemming. Marteilia sp. var oftest observert i hoppekrepsene Acartia cf. margalefi (begge kjønn) og Paracartia grani (begge kjønn, samt copepodittstadie V). P. grani er bekreftet som alternativ vert hos M. refringens sensu lato. Denne hoppekrepsen var hovedsakelig observert i poller hvor M. pararefringens var til stede i blåskjellene, med få unntak: i Innerøypollen var den observert i høyt antall, mens Hardbakkepollen og Kvernepollen var den observert i få eksemplarer. Disse pollene var negative for parasitten. Videre forskning kreves for å avdekke mulige mellomverter av M. pararefringens og bekreftelse på infeksjoner ved bruk av in situ hybridisering må utføres. Parasittens krav til miljø og hvor den befinner seg utenom blåskjellet (f.eks sedimenter og vann) må utforskes for å få en komplett forståelse av dens livssyklus.

Undersøkelser av ville flatøsters fra alle pollene hvor M. pararefringens er bekreftet i blåskjell, viste ingen tegn til sykdom. Noen flatøsters var svakt PCR positive for parasitten sannsynligvis på grunn av passivt opptak av sporer fra vannet. Naive flatøsters fra Innerøypollen, som har vært inkludert i OK programmet i mange år, var heller ikke mottakelige for M. pararefringens. Våre funn bekrefter at M. pararefringens er en egen art som infiserer blåskjell, ikke flatøsters.

Norway has had a monitoring programme for the disease marteiliosis, caused by the protistan parasite Marteilia refringens, in flat oysters Ostrea edulis and mussels Mytilus spp. since 1989 and 2010, respectively. The parasite was not detected in either species until 2016, when mussels sampled from a previously active flat oyster breed-poll, Agapollen, on the west coast were found heavily infected by the parasite. Marteiliosis had not been detected in cohabiting flat oysters from the same site. Though reported as M. refringens Type M, this parasite has been separated from M. refringens and been named Marteilia pararefringens with distinct host preferences. After the surprising discovery of M. pararefringens, it was found that Marteilia sp. had been reported from Norwegian mussels 10 years earlier, coincidentally observed during a pollution study from the Haugesund area in 2006-2007. This finding had not been reported to the competent authority. The presence of marteiliosis in mussels, and the apparent failure of the surveillance programme to efficiently detect them, motivated research on the geographic distribution of Marteilia spp. in mussels in Norway, particularly its ability to propagate in poll systems (including potential intermediate hosts), its spreading potential, and host susceptibility to the disease.

Through deployments of uninfected mussels in Agapollen, that were regularly sampled, we found that M. pararefringens infections are contracted in early summer as the temperature in the poll increases. The parasite can develop and mature rapidly, from no histologically observable infections (but PCR positive mussels) to heavy infections with sporulating stages within a 3-week period. Sporulating stages are present throughout the autumn. Sporulating stages can also be present in late spring, likely dormant from the previous year, indicating that sporulation can take place as soon as required environmental factors are met.

Host haemocytic reaction and susceptibility to M. pararefringens infections can vary between individual mussels subjected to the same infection pressure, suggesting a genetic component affecting susceptibility to the parasite. The studies showed, for the first time, that Mytilus trossulus was susceptible to M. pararefringens, with heavy intensities and massive haemocytic infiltration observed in the digestive gland of two individuals from Espevikpollen. All mussel sizes, from newly settled spat to large (>100 mm) mussels can be infected.

To describe the geographical distribution of M. pararefringens, mussels from 11 breed-polls (or similar natural sites), 17 spat-polls (or similar natural sites), and eight other sites (fjord inlets/sheltered bays) were screened by PCR. Positive results were confirmed by histology. M. pararefringens was detected in mussels from five of the breed-polls that were used in flat oyster production networks on the west coast. However, the parasite was also detected in mussels from two threshold fjord systems not associated with any known bivalve aquaculture activity. The parasite apparently has a patchy distribution, occurring in three areas: Fjaler/Solund, Bømlo/Tysnes, and Kristiansand. The parasite was not detected in any spat-poll and its distribution does not suggest a spread inadvertently via the flat oyster networks (e.g. biofouling of infected mussels or spores on flat oysters or equipment) or passively via currents. We did not detect marteiliosis in our revisits to Høgevarden and Tysværvågen (Haugesund area) where Aarab et al. (2011) reported the parasite, suggesting that the parasite has disappeared or was not detectable by our sampling strategy. Potential environmental reservoirs of M. pararefringens, outside the mussel host, should be studied further to clarify the parasite’s presence at these sites.

M. pararefringens cannot transmit horizontally and requires one or several intermediate hosts in its life cycle. Zooplankton are the most likely host candidates. Zooplankton were sampled from 30 sites where M. pararefringens prevalence in local mussel populations is known. Of the seven positive sites, only samples from two were positive by PCR analysis, those from Agapollen and Pollevik. Biweekly samples from Agapollen, from early April to November 2021, revealed Marteilia sp. positive zooplankton in early June, peaking in late June/early July before disappearing. Marteilia sp. was present again in late August and September but was not detected in November as the zooplankton were gone from the poll water.

Zooplankton samples were sorted by stereomicroscopy to their lowest identifiable taxa and PCR analysed. Metabarcoding was used on bulk and sorted samples to help identify cryptic (i.e. Acartia spp.) and rare species missed by traditional methods. Marteilia sp. was repeatedly detected in the copepods Acartia cf. margalefi (male and female) and Paracartia grani (male, female, and female copepodite V-stage). P. grani is an alternate host of M. refringens sensu lato in France as infections have been found in female copepod gonads. P. grani was mainly detected in the sites where M. pararefringens was detected in mussels. However, it was present in three Marteilia negative sites: Innerøypollen, where it was abundant, while rare in Hardbakkepollen and Kvernepollen. It was not detected by stereomicroscopy at all in any of the other negative sites. Further research is required to elucidate candidate intermediate hosts of M. pararefringens. The parasites potential environmental reservoirs, such as sediments and water, as well as its life cycle requirements must be prioritized in future studies.

Examination of wild flat oysters from polls where M. pararefringens occur in the mussels have not revealed histological evidence that they are susceptible. Some weakly PCR positive oysters have likely filtered M. pararefringens spores from the water, causing a positive signal in the digestive gland. Naïve flat oysters placed in an enzootic M. pararefringens site did not become infected either, demonstrating that they are not a susceptible host. This supports recent studies separating M. refringens sensu stricto and M. pararefringens as parasite species with distinct host preferences, with M. pararefringens infecting mussels Mytilus spp.