Identification and characterization of a novel gene associated with hereditary retinal disorder(s)

Abstract

Bakgrunn: Retinitis pigmentosa (RP) er kjent som den vanligst forekommende arvelige retinale dystrofi med en prevalens på nesten 1:4000 på verdensbasis. RP skyldes i utgangspunktet tap av stav fotoreseptorer, ledsaget av redusert nattsyn og innsnevring av synsfeltet. Senere oppstår tap av tapp fotoreseptorer som fører til tap av sentralsyn. I en familie der to søsken ble diagnostisert med ikke-syndromisk RP, fant vi en homozygot mutasjon i genet all-trans retinoic acid induced differentiation factor (ATRAID) som førte til en tidlig terminering av proteinet.

Mål: ATRAID er et lite karakterisert protein. Målet var å karakterisere ATRAID mer detaljert og å finne støtte for dets rolle i utviklingen av RP.

Måloppgave 1: Funksjonell karakterisering av ATRAID.

Måloppgave 2: Undersøk subcellulær lokalisering av ATRAID.

Måloppgave 3: Finn den mulige kausale mutasjonen som forårsaker ikke-syndromisk RP i en bestemt familie. Videre å undersøk fenotypen til mus som ikke utrykker Atraid.

Metoder: Oppgave 1: In silico analyse, Cellekultur, Konstruksjon av retrovirale vektorer, Transduksjon, Transient transfeksjon, Subcellulær fraksjonering, Inhibitorbehandling, Antigen «retrieval», Immunfluorescensanalyse, Immunoblotanalyse.

Oppgave 2: Cellekultur, Konstruksjon av retrovirale vektorer, Transduksjon, Antigen «retrieval», Immunfluorescensanalyse.

Oppgave 3: Klinisk undersøkelse, Eksomsekvensering Cellekultur, Immunoblotanalyse, Dyremodell, Histopatologisk farging, Immunfluorescensanalyse, Transmisjonselektronmikroskopi.

Resultater:

Artikkel 1: Hovedisoformen av ATRAID er en N-glykosylert form av Isoform C (Iso C). Isoform A ser ut til å bli raskt nedbrutt av proteasomer etter syntesen. I celler transfektert med et konstrukt som er predikert å uttrykke Isoform B, var det isteden Iso C som ble syntetisert. Iso C viser en punktformet fordeling i cytoplasmaet med høy konsentrasjon i det juxtanukleære området. Høy konsentrasjon av ATRAID ble sett i Golgi-området. I tillegg fant vi at lokaliseringen av proteinet overlappet med både RAB11, en markør for resirkulerende endosomer, og de lysosymale markørproteinene LAMP1 og LAMP2.

Artikkel 2: Lokalisering av ATRAID Iso C er ikke begrenset til lysosomene. Den følger tett lokaliseringen av transferrin og transferrinreseptorene som er lokalisert til clathrin-belagte vesikler. Dessuten finnes det sammen eller nær RAB5, EEA1, RAB7 og RAB9 som er markører for henholdsvis tidlige og sene endosomer.

Artikkel 3: To søsken viste typiske trekk ved ikke-syndromisk retinitis pigmentosa, med tap av perifert synsfelt, reduserte fullfelts elektroretinogram amplituder, og tap av RPE og fotoreseptorer visualisert ved OCT. Eksomsekvensering avdekket en variant, NM_001170795.3(ATRAID), c.120dupG, p.Ser41Glufs*13, som fører til prematur terminering av ATRAID protein syntese. I en Atraid-/- musemodell ble tegn på RPE og fotoreseptor degenerasjon sett hos to av fem mus.

Konklusjoner: I dette prosjektet fant vi at hoved isoformen av ATRAID (Iso C) var til stede ikke bare i lysosomer, men også i endosomer, noe som tyder på at den kan spille en rolle i det endosomale-lysosomale systemet eller i andre cellulære trafikkveier. Hos våre RP pasienter resulterte den observerte ATRAID-varianten i tap av proteinet. Varianter i ATRAID har ikke vært assosiert med RP tidligere. Nedbrytning av fotoreseptorer ble sett hos to av fem Atraid-/- mus. Ytterligere studier er nødvendig for å bekrefte om musene er en passende modell for RP. Vår hypotese er at tap av ATRAID kan være assosiert med utvikling av RP, blant annet gjennom dysregulering av de endosomale, lysosomale, eller andre cellulære trafikkveier, enten i retinalt pigmentepitel eller fotoreseptorer.

Background: Retinitis pigmentosa, with a prevalence of almost 1:4000 worldwide, is known as the most common inherited retinal dystrophy. It is initially characterized by loss of rod photoreceptors accompanied by reduced night vision and constriction of the visual field. Later, loss of cone photoreceptors occurs which leads to loss of central vision. In a family where two siblings were diagnosed with non-syndromic RP, we found a homozygous mutation in all‐trans retinoic acid‐induced differentiation factor (ATRAID) gene leading to a premature termination of the protein.

Objectives: ATRAID is a poorly characterized protein. The aim was to characterize ATRAID in greater detail and to provide support for its role in the development of RP.

Aims paper 1: Functional characterization of ATRAID.

Aims paper 2: Investigate subcellular localization of ATRAID.

Aims paper 3: Find the causative mutation responsible for non-syndromic RP in a particular family and examine the phenotype of an Atraid-/- mouse line.

Methods:

Paper 1: In silico analysis, Cell culture, Construction of retroviral vectors, Transduction, Transient transfection, Subcellular fractionation, Inhibitor treatment, Antigen retrieval, Immunofluorescence analysis, Immunoblot analysis.

Paper 2: Cell culture, Construction of retroviral vectors, Transduction, Antigen retrieval, Immunofluorescence analysis.

Paper 3: Clinical examination, Exome sequencing, Cell culture, Immunoblot analysis, Animal model, Histopathology staining, Immunofluorescence analysis, Transmission electron microscopy. Results:

Paper 1: The main isoform of ATRAID is Isoform C (Iso C) which is highly N-glycosylated. Isoform A appears to be rapidly degraded by proteasomes after its production. In cells transfected with a construct predicted to express Isoform B, the protein detected was indistinguishable from Iso C. Iso C shows a punctuate distribution in the cytoplasm with high concentration in the juxtanuclear area. High concentration of ATRAID was seen in the Golgi area and its overlap with RAB11, marker of recycling endosomes and LAMP1 and LAMP2, lysosomal markers were found.

Paper 2: ATRAID Iso C is not restricted to the lysosomes. It follows closely the localization of transferrin and the transferrin receptors that are localized to clathrin-coated vesicles. Moreover, it is found together or near RAB5, EEA1, RAB7 and RAB9 that are markers of early and late endosomes, respectively.

Paper 3: The two siblings showed typical features of non-syndromic retinitis pigmentosa with loss of peripheral visual field, reduced full-field electroretinogram amplitudes, and loss of RPE and photoreceptors on OCT. Exome sequencing revealed a variant, NM_001170795.3(ATRAID), c.120dupG, p.Ser41Glufs*13, that leads to loss of ATRAID expression. In Atraid-/- mouse models, signs of RPE and photoreceptor degeneration were seen in 2/5 mice.

Conclusions: In this project, we found that the main isoform of ATRAID (Iso C) was present not only in lysosomes but also in endosomes showing that it may play a role in the endosomal–lysosomal pathway or other cellular trafficking pathways. In our non-syndromic retinitis pigmentosa patients, the observed ATRAID variant resulted in a loss of ATRAID. Variants in ATRAID have not been associated with RP previously. Degradation of photoreceptors was seen in two out of five Atraid-/- mice. Further studies are needed to confirm if the mice are a suitable model for RP. We hypothesize that loss of ATRAID could be associated with the development of RP, among others through dysregulation of the endosomal lysosomal or other cellular trafficking pathways either in the retinal pigment epithelium or the photoreceptors.