Respiratory burst assay for leukocytter fra Atlantisk laks (Salmo salar L.) og Atlantisk torsk (Gadus morhua L.)

Abstract

Fagocytose er en viktig funksjon i det uspesifikke immunforsvaret hos fisk, og medvirker til at leukocytter kan drepe infiserende patogener. Leukocytters evne til å ta opp, drepe og bryte ned fagocytterte patogener, er blant annet basert på oksygenavhengig og oksygenuavhengig produksjon av ulike toksiske stoffer. Den oksygenavhengige produksjonen av de toksiske reaktive oksygenstoffene (ROS) og reaktive nitrogenstoffene (RNS), medfører en økning i leukocyttenes oksygenopptak, og benevnes som respiratory burst. Hensikten med denne oppgaven var å utvikle et respiratory burst assay for leukocytter fra Atlantisk laks (Salmo salar L.) og Atlantisk torsk (Gadus morhua L.) for å undersøke respiratory burst aktiviteten til isolerte leukocytter fra blod (PBL) og hodenyre (HKL). I denne oppgaven ble det arbeidet med å optimalisere stimulering av respiratory burst aktivitet i leukocytter fra laks og torsk med phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), for deretter å tilsette dihydrorhodamine (DHR). DHR oksideres til fluorescerende rhodamine (RHO) ved respiratory burst aktivitet i leukocyttene. RHO-fluorescensen til de respiratory burst aktiverte leukocyttene ble målt ved flow cytometri. Det utviklede assayet påviste respiratory burst aktivitet hos leukocytter fra laks og torsk, skilte godt mellom aktive og inaktive celler, og gav reproduserbare resultater. Resultatene viste at respiratory burst aktiviteten til stimulerte leukocytter varierte noe mellom individer, og også mellom PBL og HKL. Forsøksoppsettet av respiratory burst assay tilpasset lakseleukocytter måtte endres noe ved optimalisering av oppsettet for torsk. Forskjellen på andel respiratory burst aktiverte leukocytter mellom laks og torsk var liten, men leukocyttene viste noe ulik grad av RHO-fluorescensintensitet. Respiratory burst assayet ble også testet ut på leukocytter fra laks og torsk inkubert med bakterien Francisella philomiragia subsp. noatunensis, som forårsaker sykdommen francisellose hos torsk. Resultatene gav indikasjoner på at bakterien delvis hemmet respiratory burst aktiviteten hos PMA-stimulerte leukocytter fra torsk, mens respiratory burst aktiviteten i PMA-stimulerte leukocytter fra laks ble ekstra aktivert.