Sammenligning av prøveopparbeidelse og kromatografimetoder for porfyriner i urin

Abstract

Studien ble utført ved Avdeling for medisinsk biokjemi og farmakologi (MBF) ved Haukeland universitetssjukehus). Målet med studien var å undersøke om det var mulig å forenkle analyse av porfyriner i urin som består av analyttene uroporfyrin, heptaporfyrin, heksaporfyrin, pentaporfyrin, koproporfyrin I, koproporfyrin III og summen av porfyrinene totalporfyrin ved å endre metode for prøveopparbeidelse. I tillegg ble det undersøkt om endring av kromatografisk analysemetode kunne føre til bedre ytelse, særlig separasjon av porfyrin-isomerer. Studien ble godkjent av personvernombudet ved HUS. Inklusjonskriteriene for studien var prøver mottatt til utredning og kontroll av porfyrisykdom hvor totalporfyriner var over 15 nmol/mmol kreatinin. Studien ble utført på prøver hvor rutineanalyse av porfyriner i urin allerede var utført. Dagens rutinemetode for porfyriner i urin ved MBF er opparbeidelse med fast-fase ekstraksjon og analyse ved omvendt fase kromatografi (RP-HPLC) med gradient eluering med 0,1 % trifluoreddiksyre i vann og acetonitril mobilfase og zorbax eclipse XDB, C18, 1,8 µm, kolonne. To metoder for prøveopparbeidelse ble testet, en hvor urinprøvene ble fortynnetmed 1:1 H2O:(1:1 dimetylsulfoksid: trikloreddiksyre) og en annen hvor urinprøvene ble fortynnet med saltsyre. Begge de nye metodene for prøveopparbeidelse ble analysert med 0,1 % trifluoreddiksyre i vann og acetonitril mobilfase i tillegg til 1,0 M ammoniumacetat (pH 5,16) og metanol mobilfase. Deretter ble metodeytelse med parametre som konsentrasjon, selektivitet og interferens vurdert opp mot dagens rutinemetode. Kvantifisering av analyttene ble utført ved hjelp av kalibrator laget fra Chromatographic marker kit fra Frontier scientific eller spiket urin. Korrelasjonsstudier indikerte at prøver opparbeidet ved fortynning med syre ikke hadde signifikant forskjellig konsentrasjon til de som ble opparbeidet med fast-fase ekstraksjon når prøvene ble kalibrert med urin-kalibrator og analysert med 0,1 % trifluoreddiksyre. Ved kalibrering med markør var det signifikant forskjell i konsentrasjon mellom metodene ifølge den ikke-parametriske passing-bablok regresjon. Det ble ikke påvist forskjell i selektivitet og interferens. Analyse av urinprøver opparbeidet ved fortynning med syre og kromatografisk analyse med 1,0 M ammoniumacetat (pH 5,16) og metanol mobilfase førte til økt separasjon og mulighet for kvantifisering av porfyrin-isomerer som uroporfyrin I og uroporfyrin III samt heptaporfyrin I og heptaporfyrin III. Metoden hvor urinprøvene fortynnes med 1:1 H2O:(1:1 dimetylsulfoksid:trikloreddiksyre) hadde høyere kvantifiseringsgrense enn de andre metodene for opparbeidelse uavhengig av mobilfase brukt i kromatografisk analyse. Årsaken til dette er høyere grad av fortynning for denne metoden for opparbeidelse sammenlignet med de andre metodene. Konklusjonen som kan trekkes fra oppgaven er at det er mulig å endre metode for porfyriner i urin til en metode som er raskere å opparbeide, som samtidig girbedre separasjon og mulighet for kvantifisering av porfyrin-isomerer (som for eksempel uroporfyrin I og uroporfyrin III) og har minst like god metodeytelse. Da fast-fase ekstraksjon tar lang tid og har begrensninger i forhold til hvor mange prøver som opparbeides samtidig vil nye metoder være enklere å utføre. Analyse med 1,0 M ammoniumacetat, pH 5,16/metanol mobilfase fører til noe økt analysetid på instrumentet og dette resulterer i at tid fra opparbeidelse til svarutgivelse ikke vil gå ned.

The project was carried out at the Department of Medical Biochemistry and Pharmacology (MBF) at Haukeland University Hospital. The aim of the study was to investigate if it is possible to simplify analysis of the analytes uroporphyrin, heptaporphyrin, hexaporphyrin, pentaporphyrin, coproporphyrin I and coproporphyrin III by changing the method for sample preparation. It was also investigated if changing the chromatographic method would lead to better performance, especially when it comes to separation of porphyrin isomers. The project was approved by data protection officer (personvernombud) at Haukeland University Hospital and urine left over after routine analysis of porphyrins in urine was used in the project. The routine method for total porphyrins in urine at MBF consists of solid-phase extraction sample preparation followed by reverse phase chromatography with gradient elution, 0,1 % trifluoroacetic acid in water and acetonitrile mobile phase on a zorbax eclipse XDB,1.8 µm, c18 column. Two new sample preparation methods that was tested involved dilution with ether 1:1 H2O:(1:1 dimethyl sulfoxide: trichloroacetic acid) or hydrochloric acid. Both of the new sample preparation methods were tested with two sets of chromatographic conditions, 0,1 % trifluoroacetic acid in water and acetonitrile mobilfase, and 1.0 M ammoniumacetate (pH 5,16) and methanol mobile phase. For the two new methods, measured analyte concentration, selectivity and interference were compared to those of the routine method. Quantitation was performed either with the Frontier Scientific marker kit or with spiked calibrator in urine. Samples diluted with acid and analysed with 0,1 % trifluoroacetic acid in water and acetonitrile mobile phase correlates well with the routine method when calibrated with calibrator in urine. Calibration with the chromatograpich marker kit shows a significant difference in concentration between the two methods according to the non parametric Passing-Bablok regression. There is no difference in selectivity and interference. Analysis of urine samples by chromatographic analysis with 1.0 M ammoniumacetat dilution (pH 5,16) and methanol mobile phase afforded greater separation compared to 0,1 % trifluoroacetic acid in water and acetonitrile. Consequently the quantitation of both I and III isomers of uroporphyrin and heptaporfyrin could be realised. The sample preparation method in which urine samples are diluted by 1:1 H2O:(1:1 dimethyl sulfoxide: trichloroacetic acid) have a greater quantitation limit compared to the other methods regardless of chromatographic method. This higher quantitation limit is due to the higher degree of dilution in the sample preparation method. We can conclude that it is possible to change analysis of the analytes uroporphyrin, heptaporphyrin, hexaporphyrin, pentaporphyrin, coproporphyrin I and coproporphyrin III to a method with an simple and faster sample preparation, which has a better separation and possibility for quantitation of porphyrin isomers (for example uroporphyrin I and uroporphyrin III) and equally good method performance. Solid-phase extraction is time consuming and has limitations when it comes to the number of samples than can be prepared simultaneously Analysis with 1.0 M ammoniumacetate (pH 5.16) and methanol leads to an increase in runtime which results in no change in turnaround time for the analysis.