Basic mechanisms for control of appetite and feed intake in Atlantic salmon (Salmo salar)

Abstract

Atlantisk laks (Salmo salar L.) er en nøkkelart i norsk sjømateksport, og representerer 70 – 80 Mrd NOK i verdi. Den store økningen i produksjon kombinert med overfôring har bidratt til negative effekter på det marine økosystemet. Av den grunn er effektiv utnyttelse av fiskefôret avgjørende for å sikre en bærekraftig produksjon med hensyn til miljø, fiskevelferd og produksjonskostnader (>50 % av produksjonskostnadene er til fôr). En økt forståelse av de grunnleggende biologiske mekanismene som styrer sult, metthetsfølelse, og kontroll av fôropptaket, vil gi mulighet til å forbedre dagens fôringsprotokoller og derav sikre økt fôrutnyttelse. Dette inkluderer kunnskap omkring de enkelte nevroendokrine faktorer som modulerer appetitt og fôringsatferd, samt å identifisere gode biomarkører som kan brukes til å vurdere appetitt og mulig vekst hos fisk. Hos virveldyr styres matinntaket av et samspill mellom sentrale og perifere signaler som inkluderer afferente nevroner og sirkulerende faktorer som hormoner i kombinasjon med signaler fra lukt- og syn og som bidrar til å stimulere fôrinntak i forhold til dyrets ernæringsstatus. Hypothalamus har en sentral rolle i å regulere appetitt og fôringsatferd. Hos pattedyr er det beskrevet et hypotalamisk nevronalt nettverk av store, distinkte cellepopulasjoner som uttrykker de oreksigene nevropeptidene (agouti-relatert protein (AgRP), nevropeptid Y (NPY)) og de anorexigene peptidene (proopiomelanocortin (POMC), kokain- og amfetaminregulert transkripsjon (CART)). Oreksigene peptider stimulerer appetitt og sult, mens anorexigene peptider stimulerer metthet, og inhiberer sultfølelse. Disse melanocortin-nevropeptidene virker på melanokortin-4-reseptoren (MC4R) i høyere ordens nevroner og som kontrollerer både matinntak og energiforbruk. Melanocortin systemet ser ut til å være relativt godt bevart blant virveldyr, inkludert teleoster. Hos atlantisk laks som har vært gjennom en laksefisk-spesifikk fjerde runde med hel genom duplikasjon (Ss 4WGD) vil de fleste av disse genene ha flere paraloge gener som kan ha ulike funksjoner for hver genvariant. Med dette som utgangspunkt har denne PhD-studien fokusert på følgende problemstillinger; 1. Å oppdatere dagens kunnskap bilde omkring tilstedeværelse av ulike sentrale appetittgener, 2. Å gjennomføre en distribusjonsanalyse av sentrale appetittgen paraloger i hjerneregionene bulbus olfactorius (OB), telencephalon (TEL), midthjernen (MB), cerebellum (CE), hypothalamus (HYP), saccus vasculosus (SV), hypofyse (PT) og hjernestamme (BS). Dette inkluderte også en vurdering av de ulike variantenes rolle i å kontrollere appetitten ved korttidsfaste (3 eller 4 dager) hos laks. 3. Å kartlegge hvordan appetittregulerende gener i mage-hypothalamus aksen påvirkes av langtidsfaste (4 og 6 uker) hos postsmolt av atlantisk laks med utgangspunkt i fordeling og uttrykk av de ulike paraloger i ulike avsnitt i hjernen hos laks. Innledningsvis ble det utført et ‘in silico’ søk for å hente sentrale appetittgener med paralogene og isoformer fra GenBank og Ensembl. I tillegg ble et fylogenetiske trær etablert. Deretter ble en standard protokoll for å dissekere fiskehjerne i 8 regioner utviklet for å studere fordelingen av de ulike genparaloger i fiskehjernen. Analyser for revers transkriptase- kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) ble utviklet m.h.p. sekvenssammenligningene og kvantifisering av mRNA-ekspresjon av appetittgenene. Parallelt ble identiteten til de nylig identifiserte sekvensene bekreftet ved å klone qPCR produkter. ‘In silico’ analyser bekreftet tilstedeværelsen av 2 agrp (agrp1 og 2 (også kjent som asip2)), 3 npy (npya1, a2 og b), 3 pomc (pomca1, a2 og b), 10 cart (cart1a, 1b1, 1b2, 2a, 2b1, 2b2, 3a1, 3a2, 3b og 4), 4 mc4r (mc4ra1, a2, b1 og b2) og 2 ghrl (ghrl1 og 2) genparaloger i genomdatabasen for atlantisk laks. Studien rapporterer den første identifiseringen og karakteriseringen av genparaloger for mc4r, npy, cart og ‘membrane-bound O-acyltransferase domain containing 4’ (mboat4) (Eng). Analyser av fordelingen av de analyserte genene i ulike regioner i hjernen viste et bredt distribusjonsmønster med varierende områder for alle de analyserte gener. HYP, TEL, OB, MB, PT og BS som viste et høyere mRNA-uttrykk blant de 8 hjerneregionene. agrp1, pomca1 og pomca2 var sterkt uttrykt i HYP, mens uttrykk av agrp2 var høyt i TEL og pomcb i PT. npya1 (mest rikelig blant npy) og npyb ble sterkt uttrykt i TEL og npya2 i HYP. Den mest uttrykte cart paralogen var cart2b, etterfulgt av cart3b, 3a, 1b, 2a, 4 og cart1a. cart2b var høyt uttrykt i OB og TEL, cart3b i BS og MB, cart3a i TEL, MB og BS, cart2a ble hovedsakelig uttrykt i MB og HYP, mens cart4 ble uttrykt i HYP og TEL. cart1a og 1b var hadde størst uttrykk i MB. agrp1, pomca1, pomca2, cart2a, 2b, 3a, 3b, 4 og npya2 viste et betydelig uttrykk i HYP i motsetning til de andre nevropeptidene. mc4rb1 var den høyest uttrykte mc4r-paralogen, og mc4ra1, a2 og b1 viste høyere uttrykk i HYP og TEL, mens mc4rb2 var høyt uttrykt i HYP. I forsøket med kortvarig (3 dagers) faste ble det registrert en signifikant oppregulering av transkripsjonsnivået i hypothalamus agrp1 i den fastede gruppen. Dessuten var mRNA uttrykket av agrp1 signifikant negativt korrelert med tørrvektsinnholdet i magen. Korrelasjonen mellom magefylling og agrp1 mRNA-uttrykket indikerer en sammenheng mellom magefylling og metthetssignaler. Dataene indikerer videre at hypothalamus agrp1 fungerer som et oreksigent signal hos laks. Etter 4 dagers Faste viste resultatene en signifikant reduksjon av npya1 mRNA uttrykket i OB, økt npya2 mRNA ekspresjon i midthjernen, og det ble også observert en trend med økt npya2 mRNA uttrykk i hypothalamus. Blant cart-paralogene, ble kun cart2b oppregulert etter fire dagers faste i OB, MB og HYP sammenlignet med gruppen som ble fôret. I forsøket hvor postsmolt laks ble fastet over en lengre periode (opp til 6 uker) viste resultatene at K faktoren avtok i Faste gruppen sammenlignet med Fôret gruppe. qPCR-analyse viste at mRNA uttrykket av agrp1 i hypothalamus ble signifikant oppregulert etter 4 og 6 ukers faste. Blant npy-paralogene npya1 og a2 var bare npya1-nivået signifikant oppregulert etter 4 ukers faste. Mens det blant cart paralogene ble registrert ett cart2a mRNA ekspresjonsnivå som var signifikant høyt etter 4 ukers faste. I tillegg økte cart2b-nivået statistisk i etter 4 og 6 ukers faste, mens cart3a og cart4 ikke responderte på faste. Paralogene pomca1, a2 og mc4ra2 økte signifikant etter 6 ukers faste og i magevev (etter 6 uker med faste) var det en tendens til at ghrelin1 (ghrl1) nivå ble redusert. Oppsummert m.h.p. de appetittregulerende genene som ble analysert så responderte agrp1, npya1, cart2a og 2b, pomca1 og a2, mc4ra2 og ghrl1 på matmangel både etter kortvarig og langvarig sult. Ved kortvarig faste spilte agrp1 i hypothalamus en tilsynelatende oreksigen rolle, og pomca2 viste en trend som tilsier en anoreksigen rolle. Under langtidsfaste, reagerte agrp1 og npya1 etter et oreksigent mønster, mens cart2a, cart2b, pomca1 og pomca2 ble oppregulert. Dette tyder på at disse nevropeptidene deltar aktivt i appetittreguleringen, dvs. faste kan indusere en nedstengning av sult og/eller motvirke sultsignaler (agrp1 og npya1) for å spare energi ved å redusere søkeatferd, eks. svømmeaktivitet under katabolske forhold der mat ikke er tilgjengelig. Alternativt kan disse nevropeptidene være en del av en sultindusert stressrespons. Basert på dataene kan en spekulere i at nedgangen i ghrl1 mRNA-uttrykk i magesekken under katabolske forhold forårsaket av matmangel, kan komme tilbake som sultsignal når mat igjen blir tilgjengelig. Samlet antyder dataene at agrp1 er en potensiell appetittbiomarkør, selv om den tidsmessige dynamikken til uttrykket i forhold til et måltid er komplisert og må undersøkes nærmere.

Atlantic salmon (Salmo salar L.) is a key species in sea food exports of Norway and represents ca. 70 - 80 billion NOK worth annually. The extensive expansion of this fish industry combined with frequent overfeeding has contributed to potentially negative impacts on the ecosystem. As such, an efficient utilization of fish feed, with low feed conversion is vital to ensure sustainable production with regards to the environment, fish welfare, and production costs (>50% of production cost goes to feed). Thus, a clear understanding of the biological mechanisms that underly hunger and satiety, and thereby control of feed intake, would enable optimization of feeding protocols with a considerable positive impact to the salmon industry. The lack of understanding includes the contributions of key neuroendocrine players that modulate feeding and the identification of reliable biomarkers that can be used to assess appetite and potentially growth in fish. In vertebrates, food intake is controlled by the synergic actions of central and peripheral signals by afferent neurons and circulation in combination with olfactory and visual sensation, which stimulate ingestion in relation to the nutritional status of the animal. As a central control hub, the hypothalamus plays a pivotal role in regulating appetite and feeding. In mammals, hypothalamic neuronal network comprises major distinct cell populations that express the orexigenic neuropeptides (agouti-related protein (AgRP) and neuropeptide Y (NPY)) and the anorexigenic peptides (proopiomelanocortin (POMC) and cocaine and amphetamine-regulated transcript (CART)). These melanocortin neuropeptides act on the melanocortin-4 receptor (MC4R) in higher order neurons that control both food intake and energy expenditure. The melanocortin system seems to be relatively well-conserved among vertebrates, including teleost species. However, in Atlantic salmon, the salmonid-specific fourth round whole-genome duplication (Ss 4WGD) led to the presence of several paralog genes which may have resulted in divergent functions for each of them. Therefore, this PhD study focused mainly on 1. Updating the key appetite genes repertoire information. 2. Spatial distribution analysis of key appetite gene paralogs in the brain regions bulbus olfactorius/olfactory bulb (OB), telencephalon (TEL), midbrain (MB), cerebellum (CE), hypothalamus (HYP), saccus vasculosus (SV), pituitary (PT) and brainstem (BS), including a first assessment of the appetite gene paralogs’ role in controlling appetite in short-term fasting (3 or 4 days) in Atlantic salmon. 3. Based on their spatial distribution and quantitative expression in different brain regions, the last focus was to explore the impact of long-term fasting (4 and 6 weeks) on appetite regulating genes in the stomach-hypothalamic axis in Atlantic salmon postsmolts. Initially, in silico analyses were performed to retrieve the sequences of the key appetite genes with paralogs and isoforms from GenBank and Ensembl and phylogenetic trees were predicted. Next, a standard protocol for dissecting fish brain into 8 regions was developed for the brain region distribution study of the key appetite genes. For quantification of mRNA expression of the appetite genes, assays for the retrieved sequences for reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) were developed and confirmed the identity of the novel sequences by cloning the qPCR product. In silico analyses have confirmed the presence of 2 agrp (agrp1 and 2 (also known as asip2)), 3 npy (npya1, a2 and b), 3 pomc (pomca1, a2 and b), 10 cart (cart1a, 1b1, 1b2, 2a, 2b1, 2b2, 3a1, 3a2, 3b and 4), 4 mc4r (mc4ra1, a2, b1 and b2) and 2 ghrl (ghrl1 and 2) gene paralogs in the Atlantic salmon genome database. This study reports the first identification and characterization of gene paralogs for mc4r, npy, cart and membrane-bound O-acyltransferase domain containing 4 (mboat4). Brain regional distribution analyses showed a wide distribution pattern with varying range for all genes analyzed. Among 8 brain regions HYP, TEL, OB, MB, PT and BS showed higher mRNA expressions. The agrp1, pomca1 and pomca2 were highly expressed in HYP while agrp2 was high in TEL and pomcb in PT. The npya1 (most abundant among npy) and b were highly expressed in TEL and npya2 in HYP. The cart2b was the most abundant cart paralog, followed by cart3b, 3a, 1b, 2a, 4 and cart1a. The cart2b was abundant in OB and TEL, cart3b in BS and MB, cart3a in TEL, MB, and BS and cart2a was in MB and HYP whilst cart4 in HYP and TEL. The cart1a and 1b were with higher expression in MB. The agrp1, pomca1, pomca2, cart2a, 2b, 3a, 3b, 4 and npya2 showed considerable expression in HYP in contrast to the other neuropeptides. The mc4rb1 was the most abundant mc4r paralog, and mc4ra1, a2 and b1 showed higher expression in HYP and TEL whilst mc4rb2 was highly expressed in HYP. In the short-term (3 days) fasting experiment a significant upregulation of hypothalamic agrp1 transcripts levels in the Fasted group was observed. Moreover, the mRNA abundance of agrp1 was significantly negatively correlated with the stomach dry weight content. The correlation between stomach fullness and agrp1 mRNA expression suggests a possible link between the stomach filling and satiety signals. The findings reported in this study indicates that hypothalamic agrp1 acts as an orexigenic signal in Atlantic salmon. Whereas 4 days of fasting resulted in a significant decrease in mRNA expression of npya1 in the olfactory bulb, increase of npya2 in the midbrain and a trend of increase of npya2 in the hypothalamus. Among cart paralogs only cart2b was upregulated after 4 days of fasting in OB, MB, and HYP compared to Fed group. In the long-term fasting experiment, the condition (K) factor of fish significantly decreased at both samplings for Fasted group compared to Fed group. In qPCR analysis, the hypothalamic relative mRNA expression of agrp1 showed highly significant upregulation at both 4 and 6 weeks of fasting. Among npy paralogs npya1 and a2, only npya1 level was significantly upregulated at 4 weeks of fasting. Whereas among cart paralogs cart2a mRNA expression level was significantly high only at 4 weeks fasting, cart2b level increased statistically in both 4 and 6 weeks of fasting, while cart3a and cart4 did not respond to fasting. The pomca1, a2 and mc4ra2 increased significantly at 6 weeks of fasting. Whereas in stomach, at 6 weeks of fasting ghrelin1 (ghrl1) declined. Conclusively, among the appetite regulating genes that was analyzed both in short-term and long-term fasting agrp1, npya1, cart2a & 2b, pomca1 & a2, mc4ra2 and ghrl1 responded to fasting. At short-term fasting hypothalamic agrp1 acted in an orexigenic role and pomca2 showed a trend of an anorexigenic role. Whereas in long-term fasting, the agrp1 and npya1 responded as orexigenic in action while cart2a, cart2b, pomca1 and pomca2 upregulation demonstrates that the neuropeptides might play either a vital role in appetite regulation i.e., fasting may be inducing shutting down of hunger and/or counteracting on hunger signals (agrp1 and npya1) to save energy from foraging search activity in catabolic conditions or play a fasting induced stress response. It is postulated that the decline in ghrl1 mRNA expression under catabolic conditions might return as hunger signal once the food is available in the vicinity. Taken together the data reported in this study suggest agrp1 as a potential appetite biomarker gene though the temporal dynamics of the expression in relation to a meal is complicated and need to be investigated further.