3D-printed Synthetic Polymer Templates for Bone Tissue Engineering : Bulk Modifications and Osteoconduction Assessment

Abstract

Syntetiske polymerbiomaterialer er enkle å bearbeide, biologisk inerte og brukes derfor i en rekke biomedisinske applikasjoner. Forskning har i lang tid fokusert på å øke biologiske aktivitet til slike materialers, og å tilpasse egenskapene til ulike bruksområder. Tredimensjonal (3D)-printing er velegnet til framstille biomaterialmaler med stor presisjon etter bestemte designparametre. Målet med denne avhandlingen var å undersøke 3D-printede syntetiske polymermaler for bruk til dyrkning og regenerasjon av beinvev (BTE). Undersøkelsene bestod av tre faser: Først ble det utført en systematisk litteraturundersøkelse for å analysere relevante faktorer ved bruk av 3D-printede, nedbrytbare maler og virkningen deres på beinregenerering i kraniale beindefekter hos ulike dyrearter (Studie I). En meta-analyse ble utført for å sammenligne nydannelse av bein for hver materialtype (polymerer, keramer eller kompositter). Man fant at effekten på beinregenereasjon var høyest hos kompositter bestående av polymerer og biokeramer, men også materialstrukturen gitt av 3D-printing. Parallelt ble det utført en studie på funksjonalisering av 3D-printede polykaprolakton (PCL) maler med gelatin (GL) som ble testet in vitro (Studie II). Til tross for at økt mengde GL (ved 8 og 16%) forbedret osteogen differensieringen av stamceller (fra rotter) ble malene ikke videreført på grunn av materialets lave strekkfasthet. I neste fase, ble poly(lactide-co-trimethylenecarbonate) (PLATMC) sammenlignet med PCL, og man fant at PLATMC hadde gunstigere både nedbrytnings- og mekaniske egenskaper enn PCL (studie III). I tillegg viste PLATMC seg bedre egnet for å fremme mineralisering av ekstracellulær matriks (ECM) fra humane stamceller in vitro. I en subkutan implantasjonsmodell i kanin (varighet 8 uker) var vertsresponsen på PLATMC mild, med innvekst av løst bindevevs og høy infiltrasjon av celler, der PCL bar preg av tett fibrøs vevsinnkapsling. Videre, når begge malene ble implantert i skallebensdefekter i kaniner, viste PLATMC-malene størst innvekst av bein. Det ble også funnet nydannelse av bein direkte på materialoverflaten, noe som hittil ikke beskrevet for syntetiske polymer. I tredje fasen valgte man å modifisere PLATMC ved å kombinere polymeren med hydroksapatitt (HA), et mineral og en viktig komponent i beinmasse. 3D-printede blandinger med ulike andeler HA (10, 30 og 50 %) ble sammenlignet med umodifisert PLATMC og testet for fysiske og biologiske egenskaper (Studie IV). Man fant at tilsatt HA reduserte strekkfastheten sammenlignet med ren PLATMC. HA10 viste noe redusert nedbrytningshastighet og lave nivåer av frigitt kalsium, mens de høye nedbrytningsprofilene til HA30 og HA50 ble tidlig ledsaget av omfattende frigivelse av kalsium. Ved bruk av stamceller (fra menneske) (in vitro), fant man for HA10 høyere mineralisering av ECM etter 14 og 21 dager enn for PLATMC alene, mens HA30 og HA50 ikke fremmet mineralisering i like stor grad. I tillegg viste HA30 og HA50 markant mindre beininnvekst når de ble implantert i skallebeinsdefekter i kaniner. Oppsummert fant man at umodifisert 3D-printet PLATMC fremmet mineralisering av ECM både in vitro og in vivo, men at man ved å tilsette HA i for store mengder, gjennom frigivelse av kalsium, forstyrrer denne prosessen i tillegg til å redusere materialets strekkfasthet. Resultatene fra disse studiene samlet støtter bruken av 3D-printede PLATMC-maler for beinregenerering.

Synthetic polymer biomaterials are used in numerous biomedical applications providing biological inertness and ease of processing and shaping. Current research is directed towards boosting their biological activity, customized per application. 3D-printing is a promising technique for producing biomaterial templates with the required design parameters. The aim of the thesis was therefore to investigate the fabrication of osteoconductive 3D-printed synthetic polymer-based templates for bone tissue engineering (BTE). The investigation comprised three phases: In phase I, a literature survey was conducted, to review factors of relevance in applying potentially-degradable 3D-printed templates and their influence on bone regeneration in the calvarial bone defect (CBD) model, across various animal species (Study I). A meta-analysis was undertaken to compare the yield of new bone for each type of template material (polymer, ceramic or composites/blends). The highest impact on new bone formation was associated with the blended polymers and bioceramics, and the interconnected porosity generated by the 3D-printing. In parallel, an experimental study was undertaken on the functionalization of 3D-printed polycaprolactone (PCL) templates with gelatin (GL) due to its good biodegradation and biocompatibilty. Their physical and osteoconductive properties were tested in vitro (Study II). The biochemical compatibility contributed by GL (at 8 and 16%) improved the osteogenic differentiation of the seeded rat-BMSCs. However, this led to quite low tensile resistance and PCL/GL templates were therefore not studied in further in vivo trials. In phase II, poly(lactide-co-trimethylene carbonate) (PLATMC) was compared to PCL, and revealed that PLATMC had better degradation and mechanical properties than PCL (Study III), with prominent osteoconductivity and mineralized extracellular matrix (ECM) deposition (in vitro). In a subcutaneous implantation model in rabbits (8 weeks), the host response to PLATMC was mild, with loose connective tissue interface and high cellular invasion. In contrast, PCL was characterized by dense fibrous tissue encapsulation. When both templates were implanted in CBD in rabbits, PLATMC templates showed greater amount of new bone formation together with obvious contact osteogenesis presented on its surface, which was unique and unreported for a synthetic polymer before. In phase III, PLATMC was blended with hydroxyapatite (HA), in several ratios: 10 % HA (HA10), 30 % (HA30) and 50 % (HA50). Printability, physical, mechanical, and biological properties were compared (Study IV). The disclosed tensile properties of all 3D-printed HA blends were reduced, compared to PLATMC. HA10 showed reduced degradation and mild Ca release rate, while the high degradation profile of HA30 and HA50 was accompanied by massive early Ca release rates. On the biological aspect in vitro, using human-BMSCs seeded up to 28 days, HA10 disclosed higher mineralized ECM secretion at 14 and 21 days than PLATMC, while the osteoconductivity of HA30 and HA50 were markedly reduced and exhibited no advantages over pristine PLATMC templates. Moreover, HA30 and HA50, exhibited marked less osteoconductivity and reduced bone ingrowth when implanted in CBD. Thus high Ca release were correlated to reduced bone ingrowth and reduced osteoconduction, and the rate of Ca release should be considered in characterizing new HA-based templates. In summary, 3D-printed PLATMC showed promising osteoconductive activity, stimulating abundant mineralized ECM secretion in vitro, and demonstrated contact osteogenesis in vivo. However, the addition of HA reduced its tensile properties and high Ca release rates exhibited less osteoconductive properties than PLATMC. The results of these studies support the application of 3D-printed PLATMC templates for BTE.