Norovirus in Pacific Oysters : Insights into Molecular Viability Assays and Mitigation Strategies to Improve Food Safety

Abstract

Som en av de vanligste årsakene til gastroenteritt, har norovirus (NoV) vært en belastning for pasienter, helsemyndigheter og samfunnet over hele verden. Patogenet overføres gjennom inntak av infektive viruspartikler. Mange matbårne NoV utbrudd har vært knyttet til konsum av rå skalldyr, og østers ser ofte ut til å være en ansvarlig matvare. NoV har vist seg å binde til østersens fordøyelsesvev via histo-blodgruppeantigener, til sialinsyre i gjeller og mantel, og kan til og med finnes i østershemocytter. Derfor akkumulerer østers lett NoV under filtrering og påvirker virusets persistens i perioder med depurering. For å sikre et trygt produkt er det nødvendig med metoder for å oppdage infeksiøse NoV. NoV er vanskelig å dyrke, så RT-qPCR er den vanligste metoden for NoV-screening, men metoden påviser også RNA fra ikke-intakte virus. Det første målet med dette arbeidet var å finne en effektiv molekylær analysemetode for å påvise intakte og dermed smittsomme virus. For å vurdere kapsidskade ble prøvene behandlet med enzym (RNase) eller interkalerende fargestoff (PMAxx). Når det gjelder genomskade, ble langdistanse PCR-analyse benyttet, siden denne metoden er i stand til å påvise skader i virus RNAet. Ett mål for arbeidet var også å undersøke effekten av ulike virusinaktiveringsmetoder. Det dyrkbare surrogatet Tulane-virus (TuV) ble inkludert i analyser av effekten av varme, UV bestråling og klor. Effekten på dyrkbarhet (infeksjonsevne) ble så sammenlignet med RT-qPCR metoder for å vurdere hvilken molekylær metode som gir det beste målet for virusreduksjon i cellekultur. Hvor godt molekylære metoder gjenspeilte cellekultur var avhengig av inaktiveringsmetode. Reduksjoner på grunn av termisk eksponering og kapsidskade ble best oppdaget hvis PMAxx eller RNase gikk foran RT-qPCR. UV-eksponering, som hovedsakelig fører til genomskader, ble bedre vurdert med en langdistanse-PCR. Åpenbart vil en pålitelig metode som fungerer like godt for alle inaktiveringsmetoder være utfordrende å designe. Et annet mål med dette prosjektet var å evaluere temperaturutviklingen i østersvev under ulike tilberedningsprosedyrer og å vurdere om disse temperaturene var tilstrekkelige for virusreduksjon. Østers ble tilsatt både NoV og TuV og utsatt for termiske behandlinger. Avhengig av behandling ble smittsom TuV redusert med 1,2 til 3,6 log10. Hvis virusmengden i østers minner om naturlige forurensningsnivåer som beskrevet av «European Food Safety Authority» og smittsom NoV reduseres på samme måte som TuV, vil de fleste av de valgte termiske behandlingene resultere i et produkt som er trygt for konsum. Våre RT-qPCR-resultater indikerer at NoV ble mindre påvirket av de termiske behandlingene enn TuV. Dette illustrerer behovet for en reproduserbar cellekulturanalyse for å korrekt evaluere reduksjoner i smittsom NoV. Det endelige målet med dette arbeidet fokuserte på modifikasjoner i depureringsprosessen som er en utbredt praksis for å fjerne potensielle patogener fra østers. Det ble undersøkt om klorering av forurensede østers eller en endring i depureringsvanntemperaturen påvirker reduksjonen av smittefarlig virus. For dette formålet ble TuV og/eller NoV bioakkumulert i stillehavsøsters. For å vurdere effekten av klorering ble forurensede østers plassert i sjøvann inneholdende 45 ppm klor i en time. Denne behandlingen hadde imidlertid ingen effekt på infeksjonsevnen til TuV. Flere faktorer kan forklare dette, inkludert tilstedeværelsen av organisk materiale, lokaliseringen av TuV i østersens fordøyelsesvev og den lave temperaturen på sjøvann som ble brukt til klorering (10°C). Å transportere en tilstrekkelig mengde av ethvert antiviralt middel inn i østersens fordøyelseskanal er utfordrende. Som et alternativ til klorering ble effekten av forhøyede vanntemperaturer under depurering evaluert. Kontaminerte østers ble plassert ved 12°C og 17°C og infektivitet og persistens av RNA ble overvåket i en måned. TuV RNA var mer persistent enn NoV RNA. TuV sank med ≤0,7 log10, mens NoV-reduksjoner var ~1,3 log10 ved slutten av depureringsperioden. Muligens reduseres NoV-binding ved samtidig bioakkumulering av begge virus, og sesongmessig ekspresjon av reseptorer i østersen forklare denne forskjellen. Infeksiøs TuV avtok jevnt og det var en signifikant forskjell mellom de to temperaturene. Dette var mest tydelig på dag 14 og 21 da reduksjoner ved 17°C var 1,3-1,7 log10 høyere enn ved 12°C. Etter fire uker ble ikke smittsom TuV påvist ved høyere temperatur, men kunne fortsatt påvises i lave nivåer i 12°C prøver. Lengden på depureringen hadde også innvirkning på reduksjonen i virus. Etter en uke var TuV-reduksjon <1,0 log10, mens reduksjonen ble >4,0 log10 etter fire uker. Dette innebærer at en utvidelse av depureringsperioden til mer enn én uke, muligens i kombinasjon med forhøyede vanntemperaturer, kan være fordelaktig for inaktivering og fjerning av viruspatogener. Samlet sett illustrerer de presenterte resultatene viktigheten av behandlingsstrategier etter høsting for å redusere risikoen for NoV-infeksjon. Disse strategiene er avgjørende for å motvirke NoV-infeksjoner knyttet til østerskonsum, da naturlig forurensning ikke lett kan unngås i det marine miljøet, spesielt nær strandlinjen. Følgelig er depurering og bruk av antivirale midler fortsatt av relevans.

As one of the most common causes of gastroenteritis, norovirus (NoV) has been a burden on patients, health authorities and society worldwide. The pathogen is transferred through ingestion of infectious virus particles. Many food-borne NoV outbreaks have been linked to the consumption of raw shellfish, particularly oysters. NoV has been shown to bind to oyster digestive tissue via histo-blood group antigens, to sialic acid in gills and mantle, and can be found in oyster haemocytes. Thus, oysters readily accumulate NoV during filter feeding, and persistence of the virus during periods of depuration has been demonstrated. To ensure a safe product, methods to detect infectious NoV are needed. As NoV cannot be easily cultivated, RT-qPCR remains state of the art for NoV screening. Unfortunately, RNA from non-infectious virus is detected as well. The first objective of this work aimed at finding an effective molecular method to primarily detect infectious virus. To assess capsid damage, enzymatic (RNase) and viability dye (PMAxx) pre-treatments were applied. To better assess genome damage, long-range PCR analysis was utilised. The cultivable NoV surrogate Tulane virus (TuV) was exposed to inactivating conditions - heat, UV, and chlorine - to evaluate, which molecular method best approximated virus reductions in cell culture. How well molecular methods compared to cell culture depended on the inactivation mode. Reductions due to thermal exposure and capsid damage were best detected if pre-treatments preceded RT-qPCR. UV exposure, which mainly leads to genome damage, was better assessed with a long-range PCR. A reliable method that performs equally well for all modes of inactivation would be challenging to design. Another aim of this project was to evaluate temperature development in oyster tissue during various cooking procedures and to assess if these temperatures suffice for virus reduction to safe levels. Oysters were spiked with both NoV and TuV and subjected to thermal treatments. Depending on treatment, infectious TuV was reduced by 1.2 to 3.6 log10. If the virus load in oysters resembles natural contamination levels as described by the European Food Safety Authority and infectious NoV decreases in the same manner as TuV, most selected thermal treatments would result in a product safe for consumption. Our RT-qPCR results indicate that NoV was less affected by the thermal treatments than TuV. This illustrates the need for a reproducible cell culture assay to correctly evaluate reductions in infectious NoV. The final objective of this work focused on modifications in the depuration process, which is a widespread practice to remove potential pathogens from oysters. It was evaluated whether chlorination of contaminated oysters or a change in depuration water temperature influences the reduction in infectious virus. For this purpose, TuV and/or NoV were bioaccumulated in Pacific oysters. To assess the effect of chlorination, contaminated oysters were placed in sea water containing 45 ppm chlorine for one hour. However, this treatment did not have any effect on the infectivity of TuV. Several factors may account for this, including the presence of organic matter, the localisation of TuV in oyster digestive tissue and the low temperature of sea water used for chlorination (10°C). Transporting a sufficient amount of any antiviral agent into the oyster digestive tract is challenging. As an alternative to chlorination, the effect of elevated water temperatures during depuration was evaluated. Contaminated oysters were placed at 12°C and 17°C and virus infectivity and persistence of RNA were monitored over the course of one month. TuV RNA was more persistent than NoV. TuV decreased by ≤0.7 log10, while NoV reductions were ~1.3 log10 at the end of the depuration period. Possibly, reduced NoV binding during simultaneous bioaccumulation and the seasonal expression of receptors in the oyster may explain this difference. Infectious TuV decreased steadily and there was a significant difference between the two temperatures. This was most evident on days 14 and 21 when reductions at 17°C were 1.3-1.7 log10 higher than at 12°C. After four weeks, infectious TuV was not detected at the higher temperature but was still detectable at low levels in 12°C samples. The length of depuration also had an influence on the decrease in virus. TuV reductions increased from <1.0 log10 after one week to >4.0 log10 after four weeks. This implies an extension of the depuration period, possibly in combination with elevated water temperatures, may be beneficial for the inactivation and removal of viral pathogens. Overall, the presented results illustrate the importance of post-harvest processing strategies in mitigating the risk of NoV infection. These strategies are crucial in counteracting NoV infections linked to oyster consumption as natural contamination cannot easily be avoided in the marine environment, especially close to the shoreline. Accordingly, depuration and the use of antiviral agents remain of relevance.