Structural elements determining NAMPT activity

Abstract

Nikotinamidadenindinukleotid (NAD) er en hydridbærer involvert i redoksreaksjoner i metabolismen. I tillegg er NAD+ et substrat av enzymer som medierer vitale NAD+-avhengige prosesser, der dinukleotidet spaltes, og frigjør en nikotinamiddel (Nam). Vedlikehold av disse prosessene krever en kontinuerlig påfyll av NAD, som hovedsakelig gjøres av Nam-bergingsveien hos pattedyr. Det hastighetsbegrensende enzymet til denne veien, nikotinamidfosforibosyltransferase (NAMPT), bruker Nam og fosforibosylpyrofosfat (PRPP) som substrater for hvilke affiniteten øker etter NAMPTs autofosforylering på histidin 247 (pHis247) i en aktiv aminosyre. Interessant nok har pattedyret NAMPT en eksepsjonelt høy affinitet for Nam sammenlignet med bakterielle enzymer. Målet med studien var å definere de strukturelle tilpasningene til NAMPT som fører til en så høy affinitet for substratet, samt det strukturelle grunnlaget for reguleringen av Nam-affinitet.

Multippel proteinsekvensjustering identifiserte i deuterostom NAMPT forekomsten av en strekning på ti aminosyrer som danner en fleksibel overflateløkke (β1-β2-løkke). Vi undersøkte derfor den mulige innvirkningen av denne løkken på proteinstrukturen, aktiviteten og substrataffiniteten ved å bruke en mutant som mangler disse ti aminosyrene. Sletting av β1-β2-løkken reduserte drastisk affiniteten for Nam mens den generelle strukturen stort sett forble upåvirket. Videre ble et antatt kjernefysisk lokaliseringssignal identifisert i β1-β2-sløyfen. Imidlertid kunne vi ikke bekrefte dets involvering i NAMPT subcellulær lokalisering.

For å forstå hvordan pHis247 regulerer Nam-affinitet i NAMPT, sammenlignet vi bindingen av det native substratet og nikotinsyre, som har en langt lavere affinitet, ved røntgenkrystallografi og aktivitetsanalyser. Analysene førte til at vi foreslår at koordineringen av Mg2+ av fosfatgruppen til pHis247 optimaliserer posisjoneringen av PRPP, og dermed favoriserer reaksjonen med pyridinbasen.

Det evolusjonære utvalget av Nam-berging av NAMPT hos høyere dyr faller sammen med både en diversifisering av NAD-avhengig signalering og forekomsten av β1-β2-løkken. Denne β1-β2-sløyfen ser ut til å være nødvendig for å møte behovet for svært effektiv Nam-resirkulering, i tillegg til fosforyleringen av His247. Dette arbeidet gir ny innsikt i utviklingen og den katalytiske mekanismen til et viktig NAD-biosyntetisk enzym.

Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) is a hydride carrier involved in redox reactions in metabolism. Additionally, NAD+ is a substrate of enzymes that mediate vital NAD+-dependent processes, in which the dinucleotide is cleaved, releasing a nicotinamide moiety (Nam). The maintenance of these processes requires a continuous replenishment of NAD, which is mainly done by the Nam salvage pathway in mammals. The rate-limiting enzyme of this pathway, nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT), uses Nam and phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP) as substrates for which the affinity increases following NAMPT’s auto- phosphorylation on histidine 247 (pHis247), a key amino acid in the active site. Interestingly, the mammalian NAMPT has an exceptionally high affinity for Nam compared to bacterial enzymes. The goal of the study was to define the structural adaptations of NAMPT leading to such a high affinity for its substrate, as well as the structural basis of the regulation of Nam affinity.

Multiple protein sequence alignment identified in deuterostome NAMPT the occurrence of a stretch of ten amino acids which forms a flexible surface loop (β1-β2 loop). We investigated, therefore, the possible impact of this loop on the protein structure, activity and substrate affinity using a mutant lacking these ten amino acids. Deletion of the β1-β2 loop drastically reduced the affinity for Nam while the overall structure remained largely unaffected. Furthermore, a putative nuclear localization signal was identified in the β1-β2 loop. However, we could not confirm its involvement in NAMPT subcellular localization.

To understand how pHis247 regulates Nam affinity in NAMPT, we compared the binding of the native substrate and nicotinic acid, which has a far lower affinity, by X- ray crystallography and activity assays. The analyses led us to propose that the coordination of Mg2+ by the phosphate group of pHis247 optimizes the positioning of PRPP, thereby favoring the reaction with the pyridine base.

The evolutionary selection of Nam salvage by NAMPT in higher animals coincides with both a diversification of NAD-dependent signaling and the occurrence of the β1- β2 loop. This β1-β2 loop appears to be necessary to meet the need for highly efficient Nam recycling, in addition to the phosphorylation of His247. This work provides new insights into the evolution and catalytic mechanism of an important NAD biosynthetic enzyme.