Investigations of the CEL VNTR by cellular experiments and in silico analyses

Abstract

Carboxyl ester lipase (CEL) is a digestive enzyme which is secreted by acinar cells in the pancreas and released into the intestines. In addition to the globular domain responsible for lipase activity, CEL contains a C-terminal region encoded by a Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) sequence. Each repeat consists of 11 amino acid residues. The function of the VNTR region is enigmatic, but we know that it is disordered, becomes O-glycosylated and is necessary for proper secretion of CEL. The CEL VNTR is also highly polymorphic and at least two variants are confirmed to be pathogenic: CEL-MODY and CEL-HYB. These variants are associated with cellular aggregation and pancreatic disease. A third variant with only three VNTR repeats, CEL-3R, has been discovered in a Danish family, in which it co-segregates with diabetes. However, we do not know if CEL-3R is pathogenic. In this study, we attempted to investigate the properties of the CEL VNTR with a special emphasis on the Danish CEL-3R variant. To examine if CEL-3R is pathogenic, we expressed it in HEK293 cells and compared its cellular localisation and secretion to the normal CEL protein and to the pathogenic CEL-HYB variant. Further, to better understand the role of the VNTR in general, we examined its evolution and characteristics in vertebrate species by performing a phylogenetic analysis. Finally, we predicted the conformations of the CEL-3R VNTR by molecular simulations. We found that the CEL-3R variants exhibited levels of aggregation in HEK293 cells comparable to the pathological CEL-HYB variant. Still, CEL-3R displayed increased secretion compared to CEL-HYB. Moreover, we found that the CEL VNTR was present only in mammalian species. The mammalian VNTR sequences were relatively conserved, but exhibited a diverse number of repeats. A short post-VNTR sequence was also well conserved among mammals of the clade Eutheria. We were not able to correlate the number of VNTR repeats with any specific traits of the investigated mammalian species. The molecular simulations of the VNTR region of CEL-3R predicted that it forms unstructured coils and temporary turns, β-bridges and β-sheets. The O-glycosylated VNTR structure displayed a similar pattern. In conclusion, although more transfection experiments are needed, we found that the Danish CEL-3R variant may show signs of pathological aggregation. We also confirmed that the CEL VNTR probably evolved sometime between the origin of Synapsida and the formation of Eutheria and Metatheria. Finally, the typical ’EATPVPPTGDS’ repeats in the VNTR may be important for the formation of secondary structures that induce the VNTR to become compact, but still disordered.

Karboksylester-lipase (CEL) er eit fordøyingsenzym som vert skilt ut i tarmen frå acinærcellene i bukspyttkjertelen. I tillegg til det globulære domenet som er ansvarleg for lipase-aktiviteten, inneheld CEL ein C-terminal region koda av ein sekvens med eit variabelt tal av tandemrepetisjonar, ein såkalla VNTR region. Kvar repetisjon kodar for 11 aminosyrer. Funksjonen til VNTR-regionen er ikkje kjent, men me veit at han er uordna, blir O-glykosylert og er naudsynt for effektiv utskiljing av CEL. VNTR-regionen er også særs variabel (polymorf) og minst to variantar er stadfesta å vera patogene: CEL-MODY og CEL-HYB. Desse variantane er knytt til cellulær aggregering og sjukdom i bukspyttkjertelen. Ein tredje variant med berre tre repetisjonar, CEL-3R, har vorte oppdaga i ein dansk familie der han finst hjå dei medlemmane som har diabetes. Likevel veit me ikkje om CEL-3R er patogen.

I denne studia utforska me eigenskapane til VNTR-regionen til CEL, med særleg merksemd på den danske CEL-3R-varianten. For å undersøkja om CEL-3R er patogen, uttrykte me han i HEK293-celler og samanlikna distribusjon og utskiljing mot det normale CEL-proteinet i tillegg til den patogene CEL-HYB-varianten. Deretter, for å forstå rolla til VNTR-regionen, undersøkte me korleis han kunne vorte utvikla gjennom evolusjonen. Til slutt prøvde me ved å nytte simulasjonar å seie noko om kva konformasjonar VNTR-regionen til CEL-3R kan ha.

Me fann at CEL-3R-variantar viste eit nivå av aggregering i HEK293-celler som kunne minna om den patologiske CEL-HYB-varianten. Likevel hadde CEL-3R auka utskiljing samanlikna med CEL-HYB. Vidare fann me at VNTR-regionen berre var til stades i pattedyrartar. VNTR-sekvensane var konserverte i pattedyr, men talet på repetisjonar varierte sterkt. Ein kort post-VNTR-sekvens var godt konservert i kladen Eutheria (placentale pattedyr). Me fann ingen samanheng mellom talet på repetisjonar i VNTR-regionen og eigenskapar til dyra som vart undersøkte. Dei molekylære simulasjonane av VNTR-regionen til CEL-3R predikerte at han kan danna ustrukturerte kveilar og kortvarige vendingar, β-bruer og β-flak.

Me konkluderte med at den danske CEL-3R-varianten viser teikn på patologisk aggregering, men at me må gjera fleire eksperiment for å få stadfesta dette. Me fann også at VNTR-regionen til CEL sannsynlegvis vart utvikla ein gong mellom fyrste førekomst av kladen Synapsida (pattedyrliknande krypdyr) og forgreininga til Eutheria og Metatheria (pungdyr). Til slutt fann me at den typiske ’EATPVPPTGDS’-repetisjonen i VNTR-regionen kan vera viktig for danninga av sekundære strukturar. Desse strukturane fører til at regionen vert kompakt, men likevel uordna.