Development of the adaptive immune system in ballan wrasse (Labrus bergylta) and the impact of different start-feed diets

Abstract

Berggylt (Labrus bergylta) spiser hovedsakelig bløtdyr, pigghuder og krepsdyr, der også ektoparasitter som plukkes fra andre fisker kan nyttes. Denne egenskapen har ført til at berggylt nå er brukt som rensefisk innen lakseoppdrett for å begrense lakselus infestasjoner. Oppdrett av berggylt har imidlertid møtt på de samme utfordringene som ved oppdrett av andre marine arter, inkludert sen vekst og høy dødelighet i de tidlige livsstadiene. I disse larvestadiene er det adaptive immunsystemet underutviklet, og larvene er derfor mer mottakelige for infeksjoner. Denne studien har undersøkt utviklingen av de viktigste primære lymfoide organene, tymus og hodenyre, utviklingen av T- og B-celler, samt transporten av IgM til tarmlumen hos berggylt. Effekten av alternative næringskilder på disse parameterne ble også evaluert. Nyren viste seg å være det første lymfoide organet som ble utviklet, da den var til stede ved klekking, etterfulgt av tymus og milt som begge ble synlig ved stadium 3 (20-30 dager post klekking, dpk). Svært lave mRNA nivåer av gener relatert til adaptiv immunitet ble observert frem til larvestadium 5 (50 til 70 dpk). På dette stadiet ble en betydelig økning av RAG1 og RAG2, så vel som T-cellemarkørtranskripter (CD3ε, ZAP70, LCK, CD4-1 og CD8β), markører for antigenpresentasjon (MHC-IIα, CD74α) og B-cellemarkører (IgM, IgT og IgD) funnet, og lymfopoiesen starter derfor trolig på dette larvestadiet. Lokaliseringen av RAG1 i berggyltlarver viste dessuten en tydelig sonering av tymus, med en RAG1+ korteks og RAG1-CD3ε+ medulla. Det ble også observert RAG1+ immunceller samt et stort antall IgM+ celler i berggyltens eksokrine pankreas, noe som antyder at berggyltens B-celler også kan utvikles her. Effekten av to startfôrdietter på berggyltens lymfopoiese ble også evaluert, der larver av rur som er ansett som en mer optimal diett ble sammenlignet med en tradisjonell diett av rotatorier og Artemia. Høyere nivåer av omega-3 flerumettede fettsyrer (PUFA) og spesifikke mineraler ble observert når næringsinnholdet ble sammenlignet mellom disse to diettene. Disse forskjellene ble gjenspeilet i en moderat økning av visse T-cellemarkører samt en økning i tymus-størrelsen i berggylt som ble foret med rur. I fisk spiller mukosal immunitet en vital rolle, der slimhinnebarrierer med mukosa-assosierte lymfoide vev (MALT) fungerer som et primært sted for å fange opp eventuelle patogener. I berggyltlarver ble det funnet at IgM+ B-celler migrerte til tarmen tidligere enn hjelper T-celler, og disse tidlige mukosale B-cellene produserer derfor sannsynligvis naturlige antistoffer (det vil si B-celler som produserer IgM før eksponering for antigener). Disse naturlige antistoffene er trolig viktig for å beskytte larvens tarm i fravær av en funksjonell mage, som foreslått for voksen berggylt. Tilstedeværelsen av spesifikke immunglobuliner i tarmens, gjellenes og hudens slim er også avgjørende for en effektiv bekjempelse av patogener. Et molekyl kalt pIgR medierer aktiv transport av immunglobuliner over epitel hos høyerestående vertebrater, og pIgR er også identifisert i mange fiskearter. Men selv om berggyltens pIgR ble funnet å være strukturelt lik den hos andre teleoster, indikerte resultatene i denne studien på at IgM primært transporteres til tarmlumen via leverens galleganger eller gjennom bukspyttkjertelens utførselskanaler. Påvisning av IgM i berggyltegg, samt identifikasjon av sekretoriske IgT transkripter i berggyltlarver før første fôring (4 dpk), indikerer at maternal overføring av antistoffer er viktig for overlevelse av tidlige berggyltstadier. Den medfødte og adaptive delen av immunsystemet er imidlertid tett integrert. Fiskelarver er derfor avhengige av medfødte forsvarsstrategier før adaptiv immunitet modnes, og dette gjelder også for berggyltlarvene. Resultatene fra dette arbeidet indikerer når immunkompetanse tidligst kan være oppnådd under berggyltens utvikling (> 90-100 dph), noe som er viktig for å utvikle effektive vaksinasjonsstrategier. Resultatene indikerer dessuten at en startfôrdiett basert på rur kan være fordelaktig for en optimal T-celle modning i tidlige livsstadier.

Ballan wrasse (Labrus bergylta) primarily feeds on molluscs, echinoderms, and crustaceans, while also targeting ectoparasites on other fish. The latter trait has made ballan wrasse the preferred cleaner fish for managing salmon lice infestations within salmonid aquaculture. Cultivating this species is relatively new and faces challenges common to other marine species, including slow growth and high early-life mortality. During early larval stages, the adaptive immune system remains underdeveloped, making larvae more susceptible to infections. The present study investigates the development of the main primary lymphoid organs, the thymus and head kidney, the emergence of T- and B-cells, and transport of IgM into the gut lumen of ballan wrasse. The effect of early nutrition on these parameters has also been investigated. The sequence of lymphoid organ appearance started with the kidney present at hatching, followed by thymus and spleen at stage 3 (20-30 days post-hatching, dph). Transcriptomic data revealed very low baseline expression levels of genes related to adaptive immunity until larval stage 5 (50 to 70 dph). At this stage, a significant increase of RAG1 and RAG2 transcripts, as well as transcripts that are T-cell markers (including CD3ε, ZAP70, LCK, CD4-1, and CD8β), markers of antigen presentation (MHC-IIα, CD74α), and B-cell markers (IgM, IgT, and IgD) appeared, indicating lymphoid activity at this stage. The localization of RAG1 mRNA in wrasse larvae revealed a clear corticomedullary structure in the thymus with a RAG1+ cortex and RAG1- CD3ε+ medulla. Interestingly, RAG1 was abundantly expressed in small cells within pancreatic tissue. This detected expression together with the identification of a high number of IgM+ cells in the exocrine pancreas strongly suggest that B-lymphopoiesis also occurs in pancreatic tissue of ballan wrasse. When analysing nutritional differences between two start-feed diets, one being a commonly used combination of rotifers and Artemia, and the other an experimental diet comprising barnacle nauplii, variations primarily existed in the levels of omega-3 poly-unsaturated fatty acids (PUFAs) and specific minerals. These differences were reflected in specific parameters of the adaptive immune system, including an increase of the level of specific T-cell marker transcripts and an enlarged thymus size in barnacle fed larvae. In fish, mucosal immunity plays a vital role with mucosal barriers, particularly mucosa-associated lymphoid tissues (MALTs), serving as primary sites for encountering pathogens. Through the examination of ballan wrasse lymphocyte migration to developing MALTs, it was found that IgM+ B-cells reached the gut before helper T-cells. This observation indicates that B-cells play an early role in protecting young larvae, possibly by generating natural antibodies (i.e., B-cells producing IgM prior to exposure of antigens). Natural antibodies are presumably important for protecting the gut of larvae in the absence of a functional stomach, as proposed for adult ballan wrasse. The presence of secreted immunoglobulins in the mucus of gut, gills, and skin, is essential for combating pathogens and maintaining homeostasis. A molecule named pIgR mediates active transport of immunoglobulins across the epithelium in higher vertebrates, and a teleost counterpart has been reported in many species. Although wrasse pIgR was found to be structurally similar to that in other teleosts, the present results indicate that IgM is primarily transported to the gut lumen through the hepato-biliary route involving the liver, or through the pancreatic route involving the exocrine pancreas. IgM was present in eggs of ballan wrasse and transcripts of sIgT were detected in larvae prior to first feeding (4 dph), indicating that maternal transfer also occurs in ballan wrasse. The innate and adaptive arms of the immune system are closely integrated, and an extremely complex interaction of players. Fish larvae rely on innate defensive mechanisms before adaptive immunity matures, and this is also the case for ballan wrasse. Results from this work indicate when immunocompetence might be achieved during ballan wrasse development (> 90-100 dph), which is important for developing efficient vaccination strategies. Furthermore, cultivation of ballan wrasse larvae might benefit from using a barnacle diet as start-diet.