Stemness and osteogenic differentiation of induced pluripotent stem cells generated in xeno-free conditions

Abstract

Mesenkymale stamceller (MSC) har lenge vært grunnleggende i strategiene for bein tissue engineering, og er viktige i dannelsen av nytt bein. Samtidig har disse cellene flere utfordringer som gjør grundig undersøkelse ganske vanskelig. MSC-lignende celler (iMSC) frembrakt fra induserte pluripotente stamceller (iPS) har dukket opp som levedyktige alternativer til tradisjonelle MSC. Som litteraturen viser, kan iMSC dannes fra ulike typer iPS, det vil si iPS generert fra forskjellige kilder. Men; siden celleomprogrammering generelt er en tidkrevende og ineffektiv prosess, er det viktig å finne kilder av celler som er mer mottakelige for denne omdannelsen. Videre, med tanke på translasjon, bør iMSC dannes ved hjelp av xeno-frie metoder som er i samsvar med GMP-retningslinjer. Dette inkluderer isolasjon og ekspansjon av den opprinnelige cellekilden, generering og dyrking av iPS, og differensiering av iPS til iMSC. Fokuset i denne avhandlingen var derfor å utvikle en xeno-fri protokoll for å generere iMSC og deretter å vurdere iMSC sin osteogene kapasitet. I den første studien var målet å vurdere og sammenligne den osteogene potensialet til BM-MSC som ble dyrket opp i to separate xeno-frie protokoller (grunnleggende medier supplert med enten platelet lysat (PL) eller humant AB-serum). Begge xeno-frie protokollene støttet BM-MSC ekspansjon in vitro og støttet også deres osteogene differensiering både in vitro og in vivo. Til slutt ble PL valgt som det xeno-frie tillegget for de gjenværende studiene på grunn av forskjellige faktorer, inkludert, men ikke begrenset til, praktisk anvendelighet, tilgjengelighet og fremtidig anvendelighet. Den andre studien hadde som mål å lage iPS fra forskjellige donor-like fibroblastkilder (dermale, buccale og gingivale) ved hjelp av en xeno-fri, PL-basert protokoll. De genererete xeno-frie iPS ble siden sammenlignet med xenogene iPS (FBS-protokoll) fra de samme donor-matchede fibroblastene. Begge protokollene støttet generering av iPS fra de ulike fibroblastene, men fibroblastene dyrket i PL viste generelt lavere omprogrammeringseffektivitet. Videre viste munn-fibroblastene seg generelt å være vanskeligere å omprogrammere enn dermale fibroblaster. Ved vellykket generering forble iPS geno/fenotype i stor grad uberørt av både ekspansjonsbetingelsene og den opprinnelige cellekilden. Målet med den tredje studien var å differensiere de genererte xenogenene og xeno-frie iPS til iMSC, og å vurdere og sammenligne deres osteogene potensial. Begge protokollene støttet differensiering av iPS til iMSC. Videre støttet protokollene osteogen differensiering av iMSC både in vitro og in vivo. Til slutt hadde den opprinnelige cellekilden liten innvirkning på den endelige iMSC geno/fenotype og osteogene potensial. Denne avhandlingen har sett på fordelene og utfordringene som oppstår når man utleder iPS/iMSC fra ulike kilder under xeno-frie forhold. Samlet sett viser disse funnene vei for videre evaluering og undersøkelse.

Mesenchymal stem cells (MSC) have long been a cornerstone in bone tissue engineering strategies, catalyzing the formation of new bone. Nevertheless, these cells generally present with challenges making adequate investigation quite difficult. MSC-like cells (iMSC) generated from induced pluripotent stem cells (iPS) have emerged as viable alternatives to traditional MSC. As the literature has shown, iMSC can be generated from different types of iPS, i.e., iPS generated from different sources. However, since cell reprogramming is generally a tedious and inefficient process, it is vital to determine sources which are more susceptible to this procedure. Furthermore, for the purpose of translation, iMSC should be generated using xeno-free methods that are compliant with GMP guidelines. These include the isolation and expansion of the initial cell source, the generation and culture of the iPS, and the differentiation of iPS to iMSC. Hence, the focus of this thesis was to ultimately develop a xeno-free protocol for generating iMSC and to subsequently assess their osteogenic capacity. In the first study, the objective was to assess and compare the osteogenic potential of BM-MSC propagated in two separate xeno-free protocols (basal media supplemented with either platelet lysate (PL) or human AB serum). Both xeno-free protocols supported BM-MSC expansion in vitro while also supporting their osteogenic differentiation in both in vitro and in vivo settings. Eventually PL was selected as the xeno-free supplement of choice for the remaining studies due to a variety of factors including, but not limited to, practicality, availability, and future applicability. The second study aimed to generate iPS from different donor-matched fibroblast sources (dermal, buccal, and gingival) using a xeno-free, PL-based protocol. The generated xeno-free iPS were then compared to xenogenic iPS (FBS protocol) obtained from the same donor-matched fibroblasts. Both protocols supported the generation of iPS from the various fibroblasts, however, the fibroblasts propagated in PL showed generally lower reprogramming efficiencies. Furthermore, the oral fibroblasts generally proved to be more difficult to reprogram than the dermal fibroblasts. Upon successful generation, the iPS geno/phenotype remained largely unaffected by both the expansion conditions and initial cell source. The aim of the third study was to differentiate the generated xenogenic and xeno-free iPS into iMSC, and to assess and compare their osteogenic potential. Both protocols supported the differentiation of iPS into iMSC. Furthermore, the protocols supported the osteogenic differentiation of iMSC in both in vitro and in vivo settings. Finally, the initial cell source had little bearing on the eventual iMSC geno/phenotype and osteogenic potential. In the course of this thesis, we shed light on the advantages and hurdles encountered when deriving iPS/iMSC from various origins in xeno-free conditions. Collectively, these findings warrant further evaluation and investigation.