Etablering av laboratorieanalyser for å studere effekt av diabetes assosierte HNF4A genvarianter i en nyrecellelinje

Abstract

Bakgrunn: Maturity Onset Diabetes of the Young er en sjelden form for arvelig diabetes og utgjør rundt 1-3 % av all diabetes i verden. Varianter av genet (HNF4A) som koder for Hepatocyte nuclear factor 4-alpha er assosiert med MODY1, og i ekstremt sjeldne tilfeller også nyresykdom. Til tross for at diabetes generelt er ledende årsak til nyresykdom, og også assosiert med andre typer MODY, så har det vært lite fokus på nyre i diabetessammenheng, og da spesielt relatert til MODY . Hensikt: Optimalisere og etablere laboratorieanalyser for å studere effekten av MODY1- assosierte HNF4A varianter i en ny relevant nyrecellelinje (HK-2). Av laboratorieanalyser ville vi studere effekt av HNF4A varianter på HNF-4A transaktivering og endogent uttrykk av målgener i HK-2 celler ved kvantitative sanntids-PCR-analyser. Metode: Optimalisering av dyrkingsbetingelser av HK-2 cellelinje ble utført og optimal protokoll etablert. Videre ble optimalisering av plasmid transfeksjon, transaktivering (Dual Luciferase Reporter Assay) og kvantitativ sanntids-PCR utført før endelig protokoll etablert. Effekt av villtype (WT) og HNF4A varianter (R76W, R76Q, R80W) på promotor-linkede reporter plasmider (transaktivering) og HK-2 målgener (kvantitativ sanntids-PCR) ble deretter studert. Resultater: R76W viste en økt transaktiveringsaktivitet, spesielt på HNF1A promotor-linket reporter (650 %), men også på G6PC promotor-linket reporter (200 %), sammenlignet med WT HNF-4A (100 %). Bare G6PC genet viste et signifikant nedsatt uttrykk ved transfeksjon av variantene R76Q og R80W, basert på kvantitativ sanntids-PCR analyse, som korrelerer med at disse variantene viste lavere nivå av transaktiveringaktivitet av G6PC promotor (henholdsvis 90 % og 50 %). Konklusjon: Cellelinjen HK-2 er en utfordrende men relevant cellelinje i forskning og relatert til diabetesstudier, og da også for å studere effekt av varianter av MODY gener assosiert med nyresykdom, på regulering av målgener.

Background: Maturity Onset Diabetes of the Young is a rare form of diabetes with autosomal inheritance, which represents around 1-3 % of all diabetes cases worldwide. Mutations in the gene (HNF4A) that encode for Hepatocyte nuclear factor 4-alpha are associated with MODY1, and in rare cases with kidney disorder. Even though diabetes causes kidney disease, and is also associated with other MODY types, not much attention has been paid to the kidney, in the context of diabetes and MODY. Objective: Optimize and establish functional analyses to study the effect of MODY1- associated HNF4A mutations in a new relevant kidney cell line (HK-2). Furthermore, we wanted to study the effect of mutations on transactivation and endogen expression of target genes in HK-2 cells by real-time qPCR. Method: Culturing conditions for a proximal tubular cell line was optimized, and a protocol was established. Then an optimization of plasmid transfection, transactivation (Dual Luciferase Reporter Assay) and real-time qPCR was performed, and a final protocol made. The effect of wild type and HNF4A mutations (R76W, R76Q and R80W) on promoter linked reporter plasmids (transactivation) and HK-2 target genes (real-time qPCR) was studied. Results: R76W demonstrated an increased transactivation activity, especially on the HNF1A promoter-linked reporter (650 %), but also on the G6PC promoter-linked reporter (200 %), compared to the wild type HNF4A (100 %). Only the G6PC gene demonstrated a significantly reduced expression for the variants R76Q and R80W, based on the real-time qPCR, and this correlates with the variants which demonstrated a reduced level of transactivation activity on the G6PC promotor (respectively 90 % and 50 %). Conclusion: The cell line HK-2 is challenging, but relevant in not only research related to diabetes, but also for studying the effects of mutations in MODY genes associated with kidney disease, in regulation of target-genes.