Fathers´ smoking in different time windows as related to offspring's epigenetic and phenotypic outcomes

Abstract

Bakgrunn: Epidemiologiske studier tyder på at fars røyking, særlig hvis han begynner å røyke når han er svært ung (<15 år), kan påvirke overvekt og lungehelse hos fremtidige barn. Stoffene i tobakksrøyk kan føre til endring i det epigenetiske apparatet i sædcellene, og dyrestudier viser mekanismer for hvordan endring i epigenetisk status kan overføres over generasjoner. Epigenetiske mekanismer kan tenkes å forklare hvordan fars røykevaner lenge før konsepsjon kan påvirke barns tidliglivsutvikling og videre helse. Likevel har studier av røykerelaterte DNA-metyleringsendringer fram til nå stort sett fokusert på egen røyking og mors røyking, ikke røyking hos far. Det er også svært få studier som har undersøkt fars røyking i spesifikke tidsperioder før konsepsjon og etter fødselen. Gitt sårbarhetsfaser i utvikling av sædcellene, er det biologisk grunnlag for å stille spørsmål om tenår og tidlig ungdomstid utgjør en kritisk eksponerings-sensitiv periode for at røyking kan påvirke neste generasjons helse.

Formål: I) Å identifisere potensielle DNA-metyleringssignaler hos (voksne) barn assosiert med fars røykevaner. II) Å undersøke tidspunkt for foreldres røykestart prekonsepsjon og postnatalt i relasjon til deres barns kroppsmasseindeks og fettmasse, og å undersøke om assosiasjoner er modifisert av barnas kjønn, eller mediert av ulike faktorer hos foreldre og barn (foreldres BMI og røyking pakkeår; barnas egen røyking og fødselsvekt). III) Å identifisere DNA-metyleringssignaler hos (voksne) sønner og døtre relatert til fars røykestart før konsepsjon og i tidlig ungdomsalder, å undersøke om de metyleringssignalene man finner er forskjellige fra signaler assosiert med personlig røyking og mødres røyking, og å studere om noen av de identifiserte metyleringssignalene også er relatert til kroppsmasseindeks og lungehelse hos barna.

Materiale og metoder: Vi utførte epigenomvide assosiasjonsstudier (EWAS) for å undersøke DNA-metyleringsmønstre hos (voksne) barn i forhold til fars eksponering for røyking. I artikkel I studerer vi 195 barn (11-54 år) som deltok i Bergen RHINESSA eller ECRHS. I artikkel III studerer vi barn (7-50 år) fra 6 RHINESSA studiesentre, med data for fars røyking fra ECRHS; vi analyserer spesifikt fars røyking som startet før konsepsjon (N=875; kjønnsspesifikke strata med 457 sønner og 418 døtre) eller før 15 års alder (N=304). I begge artikler ble barnas DNA-metyleringstatus kvantifisert i perifert blod og ved bruk av Illumina Infinium MethylationEPIC teknologimatriser. Vi brukte Comp-p (artikkel I) og dmrff or DMRcate (artikkel III) for å søke etter differensielt metylerte regioner (DMR) (artikkel I), og vi anvendte robuste lineære regresjoner, justert for mors røykestatus, fars alder, barnas røyking/kjønn/alder/predikerte celletype proporsjoner (artikkel I) og mors røykestatus, studiesenter, barnas røyking/kjønn/alder/predikerte celletypeproporsjoner (artikkel III), for å påvise differensielt metylerte CpG-posisjoner (dmCpGs eller DMPs). I begge artikler ble det justert for inflasjon og metodefeil i teststatistikk, og i tilleggs-analyser studerte vi funksjonalitet av metyleringssignalene, samt molekylære og biologiske signalveier tilknyttet genene annotert til metyleringssignalene. I artikkel III ble det også utført EWAS i forhold til mors og barnas egen røykestatus for sammenligning med metyleringssignaler relatert til fars røykestatus. Signifikante metyleringssignaler fra fars prekonsepsjon og tidlig ungdomsrøyking ble til sist undersøkt i forhold til følgende helseutfall hos barna: noen gang hatt astma, noen gang hatt piping i brystet, vekt og BMI. I artikkel II undersøkte vi ulike prekonsepsjon (<15 år, ≥15 år) og postnatale tidspunkter for røykestart hos mødre og fedre, i forhold til kroppsmasseindeks (BMI) og fettmasseindeks (FMI) hos deres voksne barn. Vi benyttet data for mødre (N=2569) og fedre (N=2111) som hadde deltatt i de befolkningsbaserte RHINE- og ECRHS-studiene i alderen 39-65 år, og data for deres voksne barn (18-49 år, N=6487) som hadde deltatt i RHINESSA studien. BMI ble beregnet fra selvrapportert høyde og vekt, og FMI var basert på bioelektriske impedansemål tilgjengelig for en undergruppe. Assosiasjoner ble analysert med generaliserte lineære regresjonsmodeller med hensyn til korrelasjon av observasjoner innenfor studiesenter og familier, justert for foreldres utdanning, og med barnas kjønn inkludert som interaksjonsterm. Medieringsanalyser ble brukt for å undersøke om observerte assosiasjoner ble mediert via foreldrenes røyking (i pakkeår), foreldrenes BMI, barnas egen røykestatus og barnas fødselsvekt.

Resultater: Artikkel I: Vi identifiserte seks DMRs (Sidak-korrigerte P-verdier: 0,0006-0,01739) assosiert med fars røykeeksponering, annotert til gener involvert i medfødt og adaptiv immunitet (ATP6V1E1, C2), fettsyresyntese (ACSF3), utvikling av nevrale system (CTNNA2) og cellulære prosesser (WDR60). Ingen DMPs oppfylte genomvidt signifikansnivå (FDR < 0,05) etter kontroll for genomisk inflasjon (l=1,46).

Artikkel III: Vi identifiserte 2 dmCpGs (FDR<0,05 med l = 1,29) assosiert med fars røykestart før konsepsjon, og 19 dmCpGs (FDR<0,05 med l = 1,29) assosiert med fars røyking som startet før 15 års alder. I separate analyser av sønner og døtre, fant vi fire dmCpGs (KCNJ1, GRAMD4/DIP, TRIM2 og MYADML2) hos sønner og én dmCpG (LEPROT1) hos døtre relatert til fars røyking før konsepsjon (FDR <=0,05). Ingen av EWAS analysene avdekket signifikante DMR regioner. dmCpGs assosiert med fars tidlige ungdomsrøyking var beriket i promotorregioner, CpG-øyer og genkropper, og annotert til gener involvert i medfødt og adaptiv immunitet, inflammatoriske responser (TLR9, DNTT, PSTPIP2, CSF1R), og glukose- og fettmetabolisme (IRS1). I tillegg var noen av disse dmCPGs assosiert med vekt- og BMI-relaterte utfall hos barna (cg03380960 i FAM53B; cg12053348 (NA), og cg22402007 i NTRK2) og til astma (cg22402007 i NTRK2) og piping i brystet (cg11380624 (DNAJC14) og cg10981514 i TPCN1) hos barna. Metyleringssignalene knyttet til fars røyking var tydelig forskjellige fra signalene knyttet til mors og barnas egen røykeeksponering. Imidlertid passet metyleringssignalene fra våre EWAS for mors og egen røyking med det andre studier har vist. Dette styrker tilliten til våre funn vedrørende fars røyking, noe som er av særlig betydning fordi der ikke finnes kohorter med tilstrekkelige data for å gjøre en tilfredsstillende replikasjonsanalyse av fars prekonsepsjon røyking og DNA metylering hos hans (voksne) barn.

Artikkel II: begge foreldres prekonsepsjon røykestart var assosiert med økt BMI hos voksne barn (fars røykestart ≥15 år; b 0,551, 95 % KI: 0,174-0,929, p=0,004, n=2916; mors røykestart <15 år; b 1,161, 95 % KI: 0,378-1,944, p=0,004; debut ≥15 år; b 0,720, 95 % KI: 0,293-1,147, p=0,001, n=3531). I analysene av mors røykeeksponering ble det også observert en assosiasjon med økt BMI for røyking initiert postnatalt (b 2,257, 95 % KI: 1,220-3,294, p<0,001). Imidlertid var bare fars røykeeksponering også assosiert med økt fettmasse hos avkom, og viste en mer konsistent sammenheng med sønnenes fettmasse (fars røykestart <15 år; b 1,604, 95 % KI: 0,269-2,939, p=0,019; røykedebut ≥15 år; b 2,590, 95 % KI: 0,544-4,636, p=0,013, og debut etter fødsel, b 2,736, 95 % KI: 0,621-4,851, p= 0,001, n=129). Vi kunne ikke identifisere om fars alder ved røykestart hadde en betydning i dette begrensede datasettet med fettmassedata, og vi utførte ikke medieringsanalyser i denne undergruppen. Medieringsanalyser vedrørende BMI i hele datasettet indikerte at de observerte assosiasjonene mellom foreldres prekonsepsjon røykestart og barnas BMI var fullstendig mediert via foreldrenes røyking i pakkeår i barnas oppvekst (fars røykestart ≥ 15 år; indirekte effekt: b 0,482, p=0,044, mors røykestart <15 år; indirekte effekt: b 1,059, p<0,001; mors røykestart ≥15 år; indirekte effekt: b 0,833, p<0,001), og delvis mediert via foreldrenes BMI samt barnas egen røykeeksponering.

Konklusjon: Våre EWAS-resultater viste at fars røyking, særlig fars røykestart før 15 års alder, var assosiert med spesifikke DNA metyleringssignaler (dmCpGs) hos hans (voksne) barn. Videre analyser gav holdepunkter for at de identifiserte signalene er av betydning for funksjonalitet, og noen av signalene var også knyttet til kroppsmasseindeks og lungehelse hos barna. Signalene var forskjellige fra signaler knyttet til mors røyking og personlig røyking. Funnene kan tyde på at fars røyking kan påvirke fenotype hos hans fremtidige barn via påvirkning på epigenetiske mekanismer. I vår epidemiologiske studie fant vi at fars røyking var assosiert med økt fettmasse hos hans sønner. Dette støtter hypotesen om overføring via farslinje, med betydning for metabolsk fenotype hos barna. Våre medieringsanalyser passet med at en rekke aspekter bidrar til overvekt, og at vedvarende og kumulativ eksponering for foreldres røyking - ikke bare foreldres røyking før konsepsjon, er av betydning for (voksne) barns risiko for overvekt. Avhandlingen indikerer altså at fars røyking kan påvirke både det epigenetiske mønster og fenotype hos hans fremtidige barn. Imidlertid bør de identifiserte metyleringssignalene om mulig replikeres i andre studier, og ytterligere studier er nødvendig bl.a. for å analysere om sammenhengen mellom fars røyking og fenotype til fremtidige barn faktisk er mediert via spesifikke epigenetiske signaler.

Background: Epidemiological studies suggest that fathers’ smoking, particularly smoking commencing in early adolescent years, can affect their offspring’s metabolic and respiratory health. Tobacco smoke constituents have been demonstrated to induce alterations to the sperm epigenetic machinery and negatively affect the regulation of embryo development. It has also been suggested that the developmental stage of the sperm precursor cells may be important for their susceptibility to environmental agents. These observations provide plausible evidence for a cross-generational transmission of altered epigenetic states, and a potential epigenetic pathway by which the fathers’ preconception and adolescent smoking exposures can affect the early life development and health trajectories in his offspring. Yet, to date, in humans, study of the association of smoking exposures on DNA methylation changes have largely focused on personal and maternal smoking exposures. There are also few epidemiological reports that have assessed the effects of parental smoking exposures in specific time windows, commencing in preconception and postnatal years, to establish whether early adolescence is a critical exposure-sensitive period for smoking exposure to potentiate cross-generational impacts on adult offspring’s body composition and risk of obesity.

Objectives: I) To identify potential DNA methylation signals in offspring associated with fathers’ ever smoking behaviours. II) To investigate time points of parents’ preconception and postnatal smoking exposure onset in relation to phenotypic outcomes on offspring’s body mass index and fat mass, and to investigate whether associated outcomes are modified by the sex of the offspring or mediated by parental and offspring factors (parental BMI and pack years of smoking, offspring’s personal smoking and birthweight). III) To identify DNA methylation signals in male and female offspring related to fathers’ preconception and early adolescent smoking onset, to investigate whether detected methylation sites are different from signals associated with personal and maternal smoking, and to further investigate if identified dmCpGs are associated with BMI and respiratory outcomes in offspring.

Material and methods: We conducted epigenome-wide association studies (EWAS) to investigate DNA methylation patterns in relation to fathers’ ever smoking exposures (N=195) in offspring (11-54 years) participating in the RHINESSA and ECRHS studies (paper I), and in relation to fathers’ smoking commencing during preconception (N=875) and early adolescent (< age 15) years (N=304) in offspring (7-50 years) originating from 6 RHINESSA study centres (Paper III). In both papers offspring’s DNA methylation was quantified in peripheral blood using Illumina Infinium MethylationEPIC Beadchip arrays. Differentially methylated regions were detected using Comp-p (paper I) and dmrff and DMRcate (Paper III), and robust linear regressions, adjusted for mothers smoking, fathers age, offspring smoking/sex/age/cell-type proportions (paper I) and mothers smoking, study centre, offspring smoking/sex/age/cell-type proportions (paper III), were used to detect differentially methylated CpG sites (dmCpGs). In additional analyses, associations between fathers’ preconception smoking and offspring’s DNA methylation were also investigated in strata of male (N=457) and female (N=418) offspring (paper III). Both papers adjusted for inflation and bias of test statistics, and searched for enrichment of regulatory regions, gene interactions and pathways to gain insight into the molecular and biological processes of the differentially methylated sites and their annotated genes. Replication of findings was pursued in the Isle of Wight (IoW) (paper I) and the Avon Longitudinal Study of Parents and Children (ALSPAC) cohorts (paper III). In paper III, EWAS of maternal and offspring’s personal smoking were also performed for comparison with fathers’ smoking related methylation signals. In sensitivity analyses, identified dmCpGs were regressed against the following offspring outcomes; everasthma, ever-wheezing, weight and BMI.

In paper II we investigated preconception and postnatal time points of smoking onset in mothers (N=2569) and fathers (N=2111) aged 39-65, of the population based RHINE and ECRHS studies, in relation to adult RHINESSA participating offspring’s (18-49 years, N=6487) body mass index (BMI) and fat mass index (FMI). BMI was calculated from self-reported height and weight, and FMI was based on bioelectrical impedance measures in a subsample. Associations were analysed with generalized linear regression models, adjusted for parental education and clustered by study centre and family origin, and offspring sex was included as an interaction term. Mediation analyses were employed to investigate whether observed associations were mediated via parental pack years of smoking, parental BMI, offspring smoking and offspring birthweight.

Results: Paper I: we identified six DMRs in offspring (Sidak corrected P-values: 0.0006-0.01739) associated with fathers’ ever smoking exposures, annotated to genes involved in innate and adaptive immunity (ATP6V1E1, C2), fatty acid synthesis (ACSF3), as well as to neural system development (CTNNA2) and cellular processes (WDR60). No DMPs passed epigenome significance (FDR < 0.05) after controlling for genomic inflation (λ=1.46).

Paper III: we identified 2 dmCpGs in offspring (FDR<0.05 with λ=1.29) associated with fathers’ preconception smoking onset, and 19 dmCpGs (FDR<0.05 with λ=1.29) associated with fathers’ smoking commencing in early adolescent years. Sex-stratified analyses detected four dmCpGs (KCNJ1, GRAMD4/DIP, TRIM2 and MYADML2) in males and one dmCpG (LEPROT1) in females related to fathers’ preconception smoking (FDR ≤0.05). Significant DMRs were not detected in either EWAS. Of note, differentially methylated sites related to fathers’ early adolescent smoking, were enriched for promotor regions, CpG islands and gene bodies. They were distinctly different from methylation signals identified in the EWAS on maternal and personal smoking, and annotated to genes with roles in innate and adaptive immunity and inflammatory responses (TLR9, DNTT, PSTPIP2, CSF1R), as well as with glucose and fat metabolism (IRS1). Some of the identified dmCpGs were additionally associated with weight and BMI related outcomes in the offspring (cg03380960 in FAM53B; cg12053348 (NA), and cg22402007 in NTRK2) and to offspring’s ever-asthma (cg22402007 in NTRK2) and ever-wheeze (cg11380624 (DNAJC14) and cg10981514 in TPCN1). Our EWAS results have not yet been successfully replicated in an independent cohort and warrant further conformation in order to be verified as true positive findings.

Paper II: both parents’ preconception smoking onset was associated with increased BMI in adult offspring (Fathers’ onset ≥15 years; β 0.551, 95% CI: 0.174-0.929, p=0.004, n=2916; Mothers’ onset <15 years; β 1.161, 95% CI: 0.378-1.944, p=0.004; onset ≥15 years; β 0.720, 95% CI: 0.293-1.147, p=0.001, n=3531). In the maternal lineage an association was also observed when smoking was initiated in postnatal years (β 2.257, 95% CI: 1.220-3.294, p<0.001). However, only fathers’ smoking exposures were also associated with increased fat mass, and demonstrated a more consistent impact on the sons (onset <15 years; β 1.604, 95% CI: 0.269-2.939, p=0.019; onset ≥15 years; β 2.590, 95% CI: 0.544-4.636, p=0.013; and onset after birth; β 2.736, 95% CI: 0.621-4.851, p= 0.001, n=129). This relationship was not found to be more pronounced if the fathers started to smoke in early adolescent years. Although not high enough numbers to pursue in the subsample with fat mass data, independent mediation analysis indicated that the observed associations between parents’ preconception smoking onset and adult offspring BMI were fully mediated via the parents’ pack years smoked during childhood years (father onset ≥15 years; indirect effect: β 0.482, p=0.044, mother onset <15 years; indirect effect: β 1.059, p<0.001; mother onset ≥15 years; indirect effect: β 0.833, p<0.001), and partially mediated via parental BMI and offspring own smoking exposure.

Conclusion: Our novel EWAS results indicated that fathers’ smoking, particularly smoking commencing during early adolescent years, was associated with differentially methylated CpG sites in offspring. Further analyses suggested that the identified signals are functionally important, and several of the identified dmCpGs were related to BMI, weight and respiratory outcomes in the offspring suggesting father’s smoking might influence offspring phenotype through epigenetic mechanisms. The epigenetic signals related to father’s smoking were distinct from those related to mother’s or personal smoking, while our EWAS of personal and mother’s smoking showed results comparable with previous studies. This lends support to the validity of the EWAS results of father’s smoking, in the absence of available data for appropriate replication analyses. Our epidemiological study found that fathers’ smoking was associated with increased fat mass in their sons, which lends support to a specific paternal lineage transmission of male-specific responses on offspring’s body composition and obesity related phenotypes. Our mediation analyses support the multifactorial aspects contributing to obesity, and that the sustained and cumulative exposures of parental smoking trajectories, and not parental preconception smoking alone, are important for offspring risk of obesity. In conclusion, this thesis indicates that father’s smoking, in particular early onset (adolescent) smoking, may influence both the epigenetic patterns and the phenotype of his future offspring. However, the identified novel methylation signals should be replicated, if possible, in other studies, and future studies are needed in order to explore whether the associations of father’s smoking with offspring phenotype are mediated via epigenetic alterations.