The valine-3-HIB pathway in obesity, insulin resistance and fatty liver

Abstract

The prevalence of obesity has increased greatly during the last decades, along with obesity-associated conditions and diseases including insulin resistance, type 2 diabetes (T2D), non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Elevation in circulating branched-chain amino acid (BCAA) levels is associated with insulin resistance, NAFLD and risk of T2D. The valine-derived metabolite 3-hydroxyisobutyrate (3-HIB) is also elevated in insulin resistance and T2D. This points to a specific dysregulation in BCAA metabolism, but the underlying cellular mechanisms remain unclear, including which tissue(s) contribute. A greater understanding of the mechanisms may facilitate earlier detection and prevention of disease progression as well as provide a basis for the development new therapeutic treatment targets.

The aim of the present study was to gain new insight into the role of cellular BCAA metabolism in obesity and obesity-related diseases, combining data from in vitro cellular models (well-known experimental adipocyte and hepatocyte cell lines and primary and immortalized cell cultures from human and mouse), animal models (rats), and several human cohorts including people with insulin resistance, T2D, obesity and NAFLD.

In paper I, we identified the valine-derived metabolite 3-HIB as a marker of hyperglycemia and T2D, and as a regulator of white and brown adipocyte metabolism. Cellular consumption and catabolism of BCAAs as well as production of 3-HIB increased during adipogenesis in human and mouse adipocytes. Knockdown of the 3-HIB generating enzyme Hibch decreased 3-HIB release from adipocytes concomitant with reduced lipid storage, while cellular supplementation of 3-HIB showed opposite effects om mitochondrial respiration and ROS generation in white and brown adipocytes.

In paper II, rats were treated with synthetic fatty acids (FAs) that induce hepatic fatty acid oxidation and mitochondrial biogenesis, and we found marked changes in 3-HIB, methylmalonic acid (MMA) (a metabolite downstream of 3-HIB), TCA cycle intermediates and other related intermediate metabolites. Gene expression and enzyme activity data for liver, adipose tissue and skeletal muscle support a particular role for altered Hibch activity in the liver, which controls the release of 3-HIB in the valine degradation pathway. Additionally, our data also link the MMA-CoA hydrolase activity to plasma levels of MMA, an established marker of vitamin B12 status, suggesting that circulating MMA does not only reflect activity of the MMA-CoA mutase.

In paper III, we found increased liver HIBCH expression in people with fatty liver and obesity, as well as positive correlations between both liver HIBCH mRNA expression and plasma 3-HIB concentrations with liver fat in human cohorts. To investigate mechanisms that may explain these correlations, we analyzed HIBCH mRNA and 3-HIB efflux in human Huh7 hepatocytes that were induced to increase their lipid storage by FA supplementation, and found that both HIBCH expression and 3-HIB efflux increased by FA treatment. By performing HIBCH overexpression and knockdown experiments, we established a causal positive relationship between HIBCH expression and 3-HIB efflux, suggesting that the liver may be a source of circulating 3-HIB. Additionally, the HIBCH perturbations as well as addition of 3-HIB to the Huh7 cells altered key processes in energy- and lipid metabolism, as did inhibition of PDK4. Taken together, the findings point to a regulatory relationship between HIBCH and PDK4 in the control of hepatocyte metabolism and metabolic flexibility, with possible implications for the development of fatty liver and associated diseases.

In conclusion, the 3-HIB generating enzyme HIBCH may serve as important regulator of cellular energy metabolism in adipose tissue and liver, and 3-HIB is a promising biomarker of metabolic changes in these tissues in different metabolic states, reflecting altered lipid storage in adipocytes and hepatocytes in association with reduced hepatic fatty acid oxidation.

Forekomsten av fedme har økt kraftig de siste tiårene, sammen med fedme-assosierte tilstander og sykdommer inkludert insulinresistens, type 2 diabetes (T2D), ikke-alkoholisk fettleversykdom (NAFLD). Økt nivå av de forgrenede aminosyrene (BCAAs) i blodet er assosiert med insulinresistens, NAFLD og økt risiko for T2D. Metabolitten 3-hydroksyisobutyrat (3-HIB) som er nedbrytningsproduktet til den forgrenede aminosyren valin, er også forhøyet i insulinresistens og T2D. Dette peker på en spesifikk dysregulering i BCAA-metabolismen, men de underliggende cellulære mekanismene er uklare, inkludert hvilket eller hvilke vev som bidrar til dette. En større forståelse av mekanismene kan bidra til tidligere diagnostisering og forebygging av sykdomsprogresjon, samt gi grunnlag for utvikling av nye terapeutiske behandlingsmål.

Målet med denne studien var å få ny innsikt i rollen til cellulær BCAA-metabolisme i fedme og fedme-relaterte sykdommer, ved å kombinere data fra in vitro cellulære modeller (velkjente eksperimentelle adipocytt- og hepatocytt-cellelinjer og primære og immortaliserte cellekulturer fra menneske og mus), dyremodeller (rotter) og flere humane kohorter som inkluderte personer med insulinresistens, T2D, fedme og NAFLD.

I artikkel I identifiserte vi den valin-avledede metabolitten 3-HIB som en markør for hyperglykemi og T2D, og som en regulator av metabolismen til hvite og brune adipocytter. Cellulært forbruk og katabolisme av BCAAs samt produksjon av 3-HIB økte under adipogenese i adipocytter fra mus og menneske. Undertrykking av det 3-HIB-genererende enzymet Hibch reduserte 3-HIB-utskillelse fra adipocytter samtidig som lipidlagring ble redusert, mens 3-HIB-tilsetning til adipocytter viste motsatte effekter på mitokondriell respirasjon og ROS-generering i hvite og brune adipocytter.

I artikkel II ble rotter behandlet med syntetiske fettsyrer (FAs) som gir økt fettsyreoksidasjon og mitokondriell biogenese i leveren, og vi fant endringer i 3-HIB, metylmalonsyre (MMA) (en metabolitt nedstrøms for 3-HIB), mellomprodukter i TCA syklus og andre relaterte metabolitter. Genuttrykk og enzymaktivitetsdata for lever, fettvev og muskel støtter en spesiell rolle for endret Hibch-aktivitet i leveren, som kontrollerer frigjøringen av 3-HIB i nedbrytning av valin. I tillegg viser våre data at enzymaktiviteten til MMA-CoA-hydrolase også kan være med på å bestemme plasmanivået av MMA, som er en etablert markør for vitamin B12-status. Dette tyder på at sirkulerende MMA ikke bare reflekteres av enzymaktiviteten til MMA-CoA-mutasen.

I artikkel III fant vi økt genuttrykk av HIBCH i leveren hos personer med fettlever og fedme, samt positive korrelasjoner mellom både HIBCH uttrykket i leveren og plasma 3-HIB-konsentrasjoner med leverfett i humane kohorter. For å undersøke mekanismer som kan forklare disse korrelasjonene, analyserte vi HIBCH uttrykket og 3-HIB-utskilllelsen i humane Huh7-hepatocytter som ble indusert til å øke lipidlagringen ved tilsetning av fettsyrer (FAs), og fant at både HIBCH-uttrykket og 3-HIB-utskillelsen økte ved økt fettlagring i levercellene. Ved å manipulere uttrykket av HIBCH (overuttrykk og knockdown) etablerte vi en positiv årsakssammenheng mellom HIBCH-uttrykk og 3-HIB-utskillelse, noe som tyder på at leveren kan være en kilde til sirkulerende 3-HIB i blodet. I tillegg fant vi at HIBCH-manipulering og 3-HIB-tilsetning i Huh7-cellene endret nøkkelprosesser i energi- og lipidmetabolisme, og det samme gjorde hemming av PDK4. Disse funnene peker på et regulatorisk forhold mellom HIBCH og PDK4 for å kontrollere metabolismen i leveren og dens evne til metabolsk fleksibilitet, med mulige implikasjoner for utviklingen av fettlever og assosierte sykdommer.

Samlet viser våre data at det 3-HIB-genererende enzymet HIBCH kan fungere som viktig regulator for cellulær energimetabolisme i fettvevet og leveren, og 3-HIB er en lovende biomarkør for metabolske endringer i disse vevene i forskjellige metabolske tilstander, ved å reflektere endret lipidlagring i fettceller og leverceller i forbindelse med redusert fettsyreoksidasjon i leveren.