From archival tissues to systems biology: Using transcriptomics to investigate the progression of kidney disease

Abstract

Innledning: Både nyrecellekarsinom og Fabrys sykdom påvirker nyrene på en progressiv måte. Gjennom bruk av RNA-sekvenserings teknologi kan man predikere og øke forståelsen av de ulike mekanismene som driver denne sykdomsutviklingen. I Artikkel 1 siktet vi derfor på å validere miRNA sekvensering fra formalinfiksert vev. Denne metoden brukte vi så i artikkel 2 for å finne en biomarkør som kunne predikere forløpet av en subtype nyrecellekarsinom. I artikkel 3 undersøkte vi sykdomsforandringene som oppstod i nyrene til pasienter med Fabrys sykdom, både før og etter oppstart med behandling over en 10 års periode. For å kunne se videre på biomarkørene vi hadde funnet undersøkte vi i artikkel 4 variabiliteten av referansegener for qPCR.

Metoder: Vi brukte sekvensering i alle delarbeidene. I artikkel 1 studerte vi en gruppe (n=12) med nyrecellekarsinom pasienter. I artikkel 2 gjentok vi dette i en nøye matchet gruppe av lavrisiko kreft pasienter med både progressiv og ikke-progressiv (n=24) sykdom. I Paper 3 brukte vi mikrodisseksjon av biopsier fra 2 uavhengige FD kohorter, som ga oss 4 distinkte histologiske grupper. I artikkel 4 samlet vi så 30 forskjellige datasett, både våre egne og eksterne, med til sammen over 800 pasienter for å vurdere variabiliteten av n=18 referanse gener i ulike setninger. I alle delarbeidene ble de viktigste funn validert med enten qPCR, eksterne data eller immunhistokjemi.

Resultater: I artikkel 1 overlappet resultatene våre godt med flere andre artikler som ikke hadde brukt FFPE vev. I artikkel 2 klarte vi å finne en biomarkør (AGAP2-AS1) som predikerte prognosen til 23/24 pasienter, flere år (4.5 år) før metastasen ble oppdaget med standard metoder. Artikkel 3 identifiserte et nettverk av gener som ble utilstrekkelig truffet av ERT behandlingen og som korrelerte med progressiv sykdom. Vi så også at medisiner mot disse nettverkene er tilgjengelig, men disse er i dag ikke brukt i behandlingen av Fabrys sykdom. I Artikkel 4 rangerte vi 18 referansegener etter stabilitet, med YWHAZ som det mest stabile referansegenet for bruk i qPCR.

Konklusjon: FFPE biopsier utgjør et godt vevsmateriale til sekvensering demonstrert ved våre funn av AGAP2-AS1 som biomarkør i lav risiko nyrecellekarsinom og flere ulike nettverk og angrepspunkter for behandling av progressiv Fabry sykdom. Videre anbefaler vi referansegenet YWHAZ for normalisering av qPCR i nyrebiopsier.

Background: Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) and Fabry Disease (FD) are both kidney diseases with a progressing character and could both benefit from the application of sequencing technology to unravel underlying biology and to provide prognostic insights. Thus, we first aimed at validating microRNA (miRNA) sequencing from paraffin-embedded formalin-fixed (FFPE) tissue, to be used in the subsequent projects. In Paper 2 we aimed at developing a biomarker to detect the progression of low-risk ccRCC. Subsequently, we focused on examining and describing the molecular changes occurring over long-term treatment of progressive FD. Finally, in Paper 4 we aimed at validating common housekeeping genes (HKG) to be used as references in quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for the assessment of the expression of identified biomarkers.

Methods: RNAseq was performed in all papers. In paper 1 we studied a cohort of ccRCC patients (n=12) and in paper 2 a larger, closely matched, cohort of progressing and non-progressing ccRCC patients participated (n=24). In Paper 3 we microdissected kidney biopsies provided from two independent FD-cohorts and controls, consequently 4 distinct histologic compartments were sequenced. Finally, 30 datasets, both those assembled in the previous investigations and publicly available data, were interrogated for the stability of the expression of n=18 HKG in a variety of kidney diseases. In all papers key results were validated by either qPCR, immunohistochemistry (IHC) or through external validation.

Results: Our initial investigation into the validity of miRNA sequencing showed the validity of the technique. The subsequent application of sequencing technology revealed that AGAP2-AS1 correctly classified 23 of 24 cases of apparently “low risk” progressing ccRCC, 4.5 years on average, in advance of the discovery of metastases. Simultaneously we managed to infer a disease progression implicated and an enzyme replacement therapy (ERT)-resistant genetic module with several potential treatments available in FD. Finally, YWHAZ proved the superior candidate for normalization purposes in kidney tissue transcriptional analysis.

Conclusions: FFPE biopsy tissues represent viable sources of miRNA sequencing data, allowing us to identify AGAP2-AS1 as a novel biomarker of ccRCC progressing despite classification as “low risk” at the time of surgery. An ERT resistance module for FD was identified, cross-validated and further interrogated for its ability to identify biomarkers and potential targets for additional treatments. Furthermore, by using YWHAZ as a HKG in qPCR we can reliably assess transcriptomic markers in kidney tissue analysis.