Functional analyses of BRCA1 variants of unknown significance found in hereditary breast or ovarian cancer families in Norway: A tool for improved diagnosis

Abstract

Tumorsuppressorgenet BRCA1 speler mange viktige roller for å hindre tumorutvikling, og endringar i BRCA1-genet er ei av hovudårsakene til arveleg bryst- og eggstokk-kreft (HBOC). I artikkel I vart det laga ei oversikt over BRCA1-variantar påvist i familiar der ein mistenkjer HBOC ved dei fire medisinsk genetiske avdelingane i Noreg. Dei interne variantklassifiseringane vart samanlikna, og resultatet viste diskrepans i 30% av klassifiseringa mellom dei ulike laboratoria. Etter fleire digitale møter vart diskrepansen redusert til 10%, noko som viser at varianttolking bør bli oppdatert jamleg og at datadeling og nært samarbeid mellom laboratoria gir meir nøyaktige tolkingar.

I artikkel II vart 14 sjeldne BRCA1-missensvariantar frå artikkel I, alle av usikker klinisk betyding (VUSar) og fordelt langs heile genet, analysert med fleire ulike funksjonelle analyser, inkludert undersøking av proteinuttrykking og proteinstabilitet, subcellulær lokasjon og proteininteraksjon med BARD1 og PALB2. I motsetning til fleire tidlegare studiar som berre har studert separate proteindomener av BRCA1, har vi her brukt full-lengdeprotein for å betre kunne gjenskape heile den naturlege tilstanden til proteinet. Målet var å undersøke hypotesa som seier at BRCA1-missensvariantar lokalisert utanfor proteindomener med kjend funksjon ikkje er funksjonelt viktige. Totalt fire variantar lokalisert utanfor kjende domener gjorde BRCA1 proteinet meir utsett for proteasom-mediert degradering, eller ga lågare proteinstabilitet samanlikna med villtypeproteinet. Desse funna indikerer at også variantar utanfor dei kjende domenene RING, BRCT og coiled-coil kan påverke BRCA1-proteinfunksjon.

I artikkel III undersøkte vi effekten av 11 sjeldne BRCA1 VUSar frå artikkel I som var lokalisert enten i eller nær BRCT-domenet med hensyn til homologi-retta reparasjon (HRR) av dobbeltråda DNA-brot og transkripsjonell aktivering (TA). Berre ein av dei analyserte variantane viste same HRR-aktivitet som villtypeproteinet, medan alle dei andre viste signifikant redusert aktivitet. To av dei analyserte variantane viste redusert TA-aktivitet lik dei patogene kontrollane. Resultatet indikerer at fleire av variantane potensielt kan påverke BRCA1-proteinfunksjonen, men fleire studiar er nødvendige for å avklare patogeniteten til variantane. Vi framhevar også viktigheita av å samanlikne resultat frå fleire ulike funksjonelle analysemetodar. Sidan ein variant potensielt kan påverke berre ein eller nokre av funksjonane til eit proteinet er dette spesielt viktig for multifunksjonelle protein slik som BRCA1.

Dei funksjonelle analysane i artikkel II og III ga ny kunnskap, noko som bidrog til reklassifisering av sju variantar frå VUS til truleg benign, og ein variant til truleg patogen.

The tumour suppressor gene BRCA1 plays multiple roles in preventing tumour development, and alterations in the BRCA1 gene are one of the main causes of hereditary breast and ovarian cancer (HBOC). In paper I, an overview of the BRCA1 variant spectrum found in families with suspected HBOC at the four diagnostic genetic laboratories in Norway was made. The internal variant classifications were compared, which revealed discrepancies in 30% of the classification between the laboratories. The discrepancies were reduced to 10% through a series of digital meetings, which illustrates that variant interpretation needs to be regularly updated, and that data sharing and inter-laboratory collaboration improves the accuracy of variant interpretation.

In paper II, 14 rare missense BRCA1 variants from Paper II, all of uncertain clinical significance (VUSs) and distributed throughout the gene, were assessed by multiple functional analyses, i.e. protein expression levels and stability, subcellular localisation, and protein interactions with BARD1 and PALB2. In contrast to several previous studies focusing on separate domains, the full-length protein was utilised to better mimic the native state of the protein, and we aimed to investigate the hypothesis stating that BRCA1 missense variants located outside protein domains with known function are of no functional importance. In total, four variants located outside the known domains were found to make the BRCA1 protein more prone to proteasome-mediated degradation, or showed reduced protein stability compared to the wild type (WT) protein. These findings indicate that also variants located outside the RING, BRCT and coiled-coiled domains could affect the BRCA1 protein function.

In paper III, we investigated the effect of 11 rare BRCA1 VUSs selected from paper I, located either within or in close proximity to the BRCT domain, with respect to homologous recombination repair (HRR) of double stranded DNA breaks and transcriptional activation (TA). Only one variant exhibited HRR activity comparable to the WT protein, whereas all other variants showed a significantly lower activity. Two of the variants exhibited TA activity similar to the pathogenic controls. Our results thus indicate that several of the variants of interest could potentially impair BRCA1 protein function, but further studies are needed to clarify their pathogenicity. We highlight the importance of comparing results obtained from several functional assays for multifunctional proteins such as BRCA1, as a variant could potentially affect only one or some of the proteins’ multiple activities.

The functional assays performed in paper II and III provided new knowledge, which contributed to reclassification of seven of the BRCA1 variants from VUS to likely benign, and one variant to likely pathogenic.