Analysis of Polyphenols from Laminaria hyperborea for application as Life Science ingredients

Abstract

Makroalger, også kjent som tang og tare, er anerkjent som en verdifull kilde til bioaktive forbindelser. Av disse har polyfenoler fått særlig oppmerksomhet. Polyfenoler har blitt assosiert med en rekke helsefordeler, og er mest kjent for sine ulike biologiske egenskaper, så som antioksidant-, antiinflammatorisk-, antidiabetisk-, og antikreftegenskaper. og. Dette prosjektet undersøkte to typer makroalger; den brune algen Laminaria hyperborea (nor.: stortare) og grønnalgen Ulva intestinalis (nor.: tarmgrønske). De første ekstraksjonene av L. hyperborea blader var utfordrerne grunnet dere høye polysakkarid innhold. Derfor ble det utført en innledende studie med grønn algen U. intestinalis for å utforske de ulike analyseteknikkene som brukes for kvantifisering og identifisering av polyfenoler. Teknikkene som ble benyttet i denne studien inkluderte tradisjonell DAD-HPLC, en totalt-fenolinnhold (TPC) test med Folin-Ciocalteu reagens, en totalt-flavonoidinnhold (TFC) test med en AlCl3 reagens, samt 1H kvantitativ NMR (qNMR) – inkludert 2D NMR. Resultatene viste at det polyfenoliske innholdet var komplekst, og med lav konsentrasjon. For råprøven (crude) av U. intestinalis ble det totale fenolinnholdet målt til 11.3 ± 1.4 mg GAE/g ved bruk av HPLC, 5.0 ± 1.0 mg GAE/g med TPC, og 27.3 ± 2.7 mg GAE/g med qNMR. TFC-testen oppdaget imidlertid ingen flavonoider i råprøven. Denne innledende studien avdekket et sterkt behov for å optimalisere de analytiske metodene som ble benyttet. I tillegg ble det utført LC-MS karakterisering på opprensede prøver av U. intestinalis. Disse identifiserte tentativt tilstedeværelsen av flere fenolsyrer og flavonoider. Noen av disse ble også bekreftet av referansestandarder.

Etter optimalisering av TPC-testen og 1H qNMR-metoden, ble kvantifisering og sammenlikning av L. hyperborea med fire andre brunalger gjennomført. Det totale polyfenolinnholdet i L. hyperborea ble funnet å være 5.51 ± 0.00 mg GAE/g (qNMR) og 5.72 ± 0.07 mg GAE/g (TPC). For tang som tilhører Laminariaceae-familien, som vokser i sublitoralsone, viste TPC-testen og selektiv qNMR liknende, men lave polyfenolkonsentrasjoner. Samtidig ble det for tang som vokser i epilittoralsone, som Ascophyllum nodosum (nor.: grisetang) og Fucus vesiculosus (no.: blæretang), observert en større forskjell mellom TPC og qNMR resultatet. Tang som vokser i strand sonen vil bli utsatt for mer lys, noe som kan føre til at det polyfenolske innholdet består av flere polyfenoler som inneholder flere reagerende grupper enn referanse standarden (gallesyre eller floroglucinol) som benyttes, noe som kan produsere overestimering av polyfenol innholdet ved bruk at TPC testen. Det er også mulig at disse artene som vokser nærmere havoverflaten inneholder en økt mengden TPC-forstyrrende forbindelser enn artene som vokser dypere i den sublitorale sonen. For å karakterisere det polyfenoliske innholdet i L. hyperborea, ble flash-kromatografi og preparativ HPLC benyttet til å rense opp tangprøven, for å opparbeide rensede fraksjoner til bruk i analysen. Resultatene viste at prøver som var mer opprenset korresponderte med høyere polyfenolinnhold både i TPC-testen og ved selektiv qNMR. I tillegg viste ORAC-testresultatene økende antioksidantaktivitet med økende renhet.

For å identifisere den molekylære strukturen til polyfenolene i L. hyperborea, ble både lavt- og høytoppløselig LC-MS benyttet. Analysene avdekket at polyfenolinnholdet hovedsakelig var sammensatt av lavmolekylære forbindelser, der 96% av de tentativt identifiserte forbindelsene hadde masser under 800 Da. 11 polyfenoliske forbindelser ble identifisert, inkludert fenolsyrer og florotanniner, og flere ble funnet å være sulfaterte, hvilket antas å skyldes en økologisk tilpasning til det marine miljøet.

Dette prosjektet gir den først omfattende beskrivelsen av stortares polyfenoliske innhold. Resultatene gir en grundig identifisering av polyfenolinnholdet i bladene av L. hyperborea og antyder potensialet for en «total utnyttelses»-strategi innen kommersiell alginatproduksjon. Videre gir prosjektet verdifull molekylær innsikt i det fenoliske innholdet i tang, noe som gir viktig informasjon til videre forskning på tang- bioraffineriet, kjemisk økologi, og havovervåkning.

Macroalgae, or seaweed, has been recognized as a valuable source of bioactive compounds. Among these, polyphenols have gained particular attention. Polyphenols are well-known for their various bioactivities, such as antioxidant, anti-inflammatory, antidiabetic, and anticancer activities, and have been associated with a range of health benefits. This project focused on the investigation of two types of macroalgae, namely the leaf biomass of the brown algae Laminaria hyperborea (eng.: tangle/cuvie) and the green algae Ulva intestinalis (eng.: gut weed). The initial extractions of L. hyperborea leaves were challenging due to its high polysaccharide content. Therefore, an initial case study was conducted on U. intestinalis to explore the combination of analytical techniques employed for polyphenol quantification and identification in seaweeds. The techniques utilized in this investigation included DAD-HPLC, the total phenolic content (TPC) assay with the Folin–Ciocalteu (FC) reagent, total flavonoid content (TFC) assay with an AlCl3 reagent, and 1H qNMR – including 2D NMR. The analyses showed a relatively composed polyphenolic nature with lower individual concentrations. For the crude sample of U. intestinalis, the total phenolic content was found to be 11.3 ± 1.4 mg GAE/g using HPLC, 5.0 ± 1.0 mg GAE/g with TPC, and 27.3 ± 2.7 mg GAE/g with qNMR. However, the TFC assay detected no flavonoids in the crude sample. The case study strongly indicated the need for optimization of the analytical methods. In addition, characterization using LC-MS was performed on purified samples of U. intestinalis, which tentatively identified the presence of several phenolic acids and flavonoid aglycones. Some of these were confirmed using reference standards.

Following optimization of the TPC assay and the 1H qNMR method, the quantification and comparison of Laminaria hyperborea to four other brown algae was conducted. The total polyphenolic content of L. hyperborea was found to be 5.51 ± 0.00 mg GAE/g (qNMR) and 5.72 ± 0.07 mg GAE/g (TPC). For seaweeds belonging to the Laminariaceae family, which grow in the sublittoral zone, the TPC assay and selective qNMR showed similar, lower polyphenol yields. Still, a larger difference was observed between the TPC and qNMR results for seaweed growing in the eulittoral zone, such as Ascophyllum nodosum (eng.: knotted kelp) and Fucus vesiculosus (eng.: bladder wrack). Seaweed growing in more shallow waters will have higher light accessibility, possibly producing a polyphenolic pool with an increased portion of polyphenols containing an increased number of reacting groups compared to the reference standard (gallic acid or phloroglucinol) used, thus resulting in an overestimation when quantifying with the TPC assay. It is also possible that these species in more shallow waters have a higher occurrence of TPC-interfering compounds than seaweed species growing in the sublittoral zone. To characterize the polyphenolic content of L. hyperborea, flash chromatography and preparative HPLC were used to purify the seaweed sample, obtaining purified fractions for analysis. Results showed that increasing purification corresponded to higher polyphenolic content, as determined by both the TPC assay and selective qNMR. In addition, ORAC assay results revealed increasing antioxidant activity with increasing purification.

To identify the molecular structure of polyphenols in L. hyperborea, both low- and high-resolution LC-MS were utilized. Analysis showed that the polyphenolic matrix was mostly composed of low-molecular weight polyphenols, with 96% of the tentatively identified compounds having masses below 800 Da. Eleven polyphenolic compounds were confirmed, including phenolic acids and phlorotannins, and several were found to be sulfated, which is believed to be an ecological adaptation to the marine environment.

This project provides the first comprehensive characterization of the polyphenolic content of L. hyperborea leaves. These results provide a characterization of the polyphenolic content of L. hyperborea’s leaf biomass, important for the implementation of a “total utilization” strategy in commercial alginate production. Moreover, the project provides valuable molecular-level insights into the phenolic content of seaweed, yielding valuable implications for research across disciplines, such as in the seaweed biorefinery, chemical ecology, and ocean monitoring.