Functional and Prognostic Role of MicroRNAs in Cancer Associated Fibroblasts and Stroma in Oral Squamous Cell Carcinoma

Abstract

Nyere studier har vist at forandringer i bindevevscellene som omgir kreftsvulsten er viktige for utviklingen av munnhulekreft. Kreft stroma kan regulere fenotypen av kreftcellene, og på den måten kan påvirke klinisk forløpet av kreftsykdommen. Målet med denne studien var å undersøke dereguleringen av mikro-RNA (miRNAs) i kreft assosierte fibroblaster (KAF) i oralt plateepitelkarsinom (OPK). KAF og normale orale fibroblaster (NOF) ble isolert fra biopsier av pasienter med OPK og friske individer etter informert samtykke. Globalt miR-uttrykk ble profilert ved bruk av Illumina versjon 2-paneler. Uovervåket gruppering av KAF og NOF etter globalt miR-uttrykk viste separate klynger for KAF og NOF, og SAM analysen påviste 12 miRNAs som uttrykes ulikt i KAF og NOF. Den funksjonelle rollen av to ulikt uttrykte miRNA-er, miR-204 og miR138, ble vurdert i 2D- og 3D-organotypiske ko- kulturer ved bruk av miRNA-mimik og hemmere. Ved å modulere miR-204- ekspresjon i KAF ble deres morfologi og motilitet endret, og dette påvirket invasjonen av kreftcellene i 3D-organotypiske ko-kulturmodeller. Videre, viste 3'UTR miRNA-målreporteranalyse at ITGA11 var et direkte mål for miR-204. Disse funnene påviste at miR-204 har en tumorundertrykkende funksjon ved å hemme migrasjonen av fibroblaster gjennom modulering av uttrykket av flere forskjellige molekyler og ved direkte målretting av ITGA11. I tillegg, ble miR-204 i bindevevet identifisert som en uavhengig prognostisk biomarkør for OPK. Uttrykk av miR-138 viste markert heterogenitet både i OPK vev fra pasienter og i dyrkete fibroblaster. Ektopisk utrykk av miR-138 reduserte fibroblastenes motilitet og sine evner til å kontrahere kollagen, og undertrykket invasjonen av nærliggende OPK celler. Hemming av miR-138 resulterte i motsatt resultat. Transkripsjon og proteinundersøkelsene viste at antitumor effekten av miR-138 i KAF var assosiert med endringer av KAF-fenotypespesifikke molekyler, fokal adhesjonskinaseakse og TGFβ1-signalveien. Samlet, viser resultatene av denne avhandlingen betydelige endringer av miRNA utrykk i bindevevet av OPK samenlignet med fibroblaster fra normal munnslimhinne og identifiserer miR-204 og miR-138 som har tumorundertrykkende funksjon ved å endre KAF sin fenotype og motilitet.

Recent studies have shown that in addition to the transformation of epithelial cells, dysfunction of stroma is crucial in oral carcinogenesis, and cancer-associated stroma can regulate the phenotype of cancer cells and influence the clinical outcome. The aim of this study was to investigate the role of micro RNAs (miRNAs) dysregulation in cancer-associated fibroblasts (CAF) in oral squamous cell carcinoma (OSCC). CAF and normal oral fibroblasts (NOF) were isolated from biopsies of OSCC patients and healthy individuals after informed consent. Global miRNA expression was first profiled using Illumina version 2 panels. Unsupervised clustering of global miRNA expression showed two separate clusters for CAF and NOF, and SAM analysis revealed significant differential expression of 12 miRNAs between CAF and NOF. Functional impact of two significantly Differentially expressed miRNAs between CAF and NOF, miR-204 and miR138, was assessed in 2D and 3D-organotypic co-cultures using miRNA mimic and inhibitors. Modulation of miR-204 expression in CAF resulted in alteration of their motility with effect on suprajacent OSCC cell invasion in 3D- organotypic co-culture models. Furthermore, 3 ́UTR miRNA target reporter assay showed ITGA11 as a direct target of miR-204 in CAF. In conclusion, these results showed that miR-204 has a tumor suppressive function through inhibition of fibroblast migration by modulating the expression of several different molecules and by directly targeting ITGA11. Moreover, stromal miR-204 was identified as an independent prognostic biomarker for OSCC patient survival. On the other hand, expression of miR- 138 showed marked heterogeneity both in OSCC tissues and cultured fibroblasts. Ectopic miR-138 expression altered fibroblasts’ morphology, reduced their motility and collagen contraction ability, and suppressed invasion of suprajacent OSCC cells in 3D models. Inhibition of miR-138 resulted in the opposite outcome. Transcript and protein examination showed that the anti-tumour effect of miR-138 in CAFs was associated to changes in CAF phenotype-specific molecules, focal adhesion kinase axis, and TGFβ1 signaling pathway. Taken together, results of this thesis demonstrate significant alteration of miRNAs in the stromal compartment of OSCC and identify miR-204 and miR-138 with a tumour suppressive function when expressed in CAF.