The Zebrafish Larva as a Model System for Myeloid Malignancies

Abstract

Myeloid kreft er ein ukontrollert deling av dei myeloide stamcellene som finst i beinmergen. Døme på myeloid kreft er akutt myeloid leukemi (AML) og myelodysplastisk syndrom. Desse kreftformane er vanlegast hjå eldre pasientar og er assosierte med dårlege prognosar. Dei noverande behandlingane består av kjemoterapi eller hematopoietisk stamcelletransplantasjon, begge tøffe behandlingar som vert dårleg tolerert av eldre og skrøpelege pasientar, og det einaste alternativet for mange er ikkje-kurativ behandling. Det er altså eit stort behov for nye behandlingsalternativ for myeloide kreftformer. I det siste har sebrafisklarver vorte populær innan legemiddelutvikling som ein modell for tidleg in vivo utprøving. Samanlikna med andre dyremodellar som mus, har sebrafisklarver fleire fordelar som liten storleik, og transparens, som mogleggjer avbilding av fluorescerande celler in vivo. Vidare kan ein oppnå resultat i løpet av dagar i staden for månader. I dette arbeidet hadde vi som mål å forbetra sebrafisklarver som modell for myeloid kreft, samt evaluera våre nye verktøy. Dette gjennomførte vi ved å utvikle et nytt programvareverktøy for å forbetre datainnsamlinga og handsaminga, etterfølgt av validering av denne programvara gjennom undersøkinga av ein ny legemiddelkandidat, EHop-016, og ein legemiddelbærar, grafén. Vårt programvareverktøy viste seg å være avgjerande for vårt arbeid. Ved hjelp av dette verktøyet kunne vi raskt segmentera og måla celler frå konfokalbilete av larver, som vidare gav betydeleg forbetra utbyttet av dei påfølgande studiane. I vår undersøking av EHop-016 viste denne modellen at EHop-016 hadde evne til å hemma migrasjon av AML-celler frå blodet til den hematopoietiske nisja. En kombinasjonsstudie med daunorubisin in vitro synte synergistiske effektar, noko vi også kunne demonstrera i sebrafisklarver. For undersøkinga av legemiddelbæraren grafén, ønskte vi å studera i kva grad to ulike produksjonsmetodar påverkja biodistribusjonen og immuninteraksjonar. Her fant vi mindre immunreaktivitet i prøver produsert gjennom mikrofluidisering samanlikna med sonikering. Ved bruk av sebrafisklarver med fluorescerande makrofager karakteriserte vi desse interaksjonane nærmare og fant eit auka tal av makrofager etter eksponering for sonikert grafén. Vårt arbeid demonstrerte verdien av sebrafiskmodellen for tidleg utvikling av nye behandlingsmåtar mot myeloid kreft. Modellen er fleksibel, og særskildt bruken av fluorescerande celler og monitorering av desse in situ i levande larver gjer verdfull innsikt. Programvareverktøyet vi utvikla, var til stor hjelp i denne forskinga og vil vera ein verdifull ressurs i slike studiar framover.

Acute myeloid leukemia (AML) and myelodysplastic neoplasms are cancers of myeloid progenitor cells in the bone marrow. These diseases are most frequently diagnosed in older patients and are characterized by poor prognoses. The current treatment regimens of chemotherapy or hematopoietic stem cell transplantation are often poorly tolerated by older patients, which fuels the need for novel treatment options. Zebrafish larvae have seen ever increasing usage as an animal model for drug development. Compared to other animal models such as mice, this model excels through its small size and transparency facilitating imaging of fluorescent cells in vivo, and short time needed for experiments. In this work we aimed to refine and evaluate the use of zebrafish larvae as a myeloid malignancy model. For this, our objectives were to develop a new software tool to improve data acquisition, followed by the validation of this software through investigation of a novel drug, EHop-016, and a nano-sized drug delivery system (NDDS), graphene. Our software tool proved to be vital for our work. Using this tool, we were able to segment and measure single cells from confocal images of larvae and position them in three dimensions, greatly improving the quality of the collected data, and thereby the value of the following studies. In our investigation of EHop-016, this model demonstrated that the in vitro findings on the drug’s effects on AML cells were possible to reproduce in vivo in zebrafish larvae. This includes both the ability of AML cells to migrate, as well as the efficiency of a combination of EHop-016 and daunorubicin. For investigation of the NDDS graphene, our research focused on the biodistribution and immunoreactivity of two different production methods for the material. Here, we found less immunoreactivity in samples produced through microfluidization compared to sonication. Using a zebrafish larvae model with fluorescent macrophages, we found an increased macrophage production following exposure to sonicated graphene. Taken together, the work presented in this thesis demonstrates the value of the zebrafish model for treatment development against myeloid malignancies through its flexibility and valuable insights gained from its combination of single cell studies in an in vivo environment. The software tool we developed greatly aided in this research and will be a valuable asset in future early preclinical in vivo studies on cancer therapy development.