Molecular mechanisms of mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases
Doctoral thesis
Permanent lenke
https://hdl.handle.net/11250/3131764Utgivelsesdato
2024-06-05Metadata
Vis full innførselSamlinger
Sammendrag
Bakgrunn
Nevrodegenerative lidelser er komplekse lidelser i sentralnervesystemet som er typisk preget av akkumulering av feilfoldede proteiner og progressiv degenerasjon og død av sårbare cellepopulasjoner i de berørte hjerneområdene. Mitokondriell dysfunksjon har vært knyttet til patogenesen av flere nevrodegenerative lidelser, inkludert Parkinsons sykdom og Alzheimers sykdom, og er et potensielt mål for nye terapeutiske tilnærminger. Imidlertid forblir mekanismene som ligger til grunn for mitokondriell dysfunksjon og dens assosiasjon med de observerte patologiske prosessene i nevrodegenerasjon ukjente.
Mål
Artikkel I: Å belyse den subcellulære og antatte mitokondrielle matriselokaliseringen av utvalgte Parkinsons sykdom-relaterte proteiner. Artikkel II: Å etablere en in vitro cellekulturmodell for kronisk, subletal hemming av mitokondriell proteintranslasjon, for å analysere effekten av mitokondriell dysfunksjon på α-synuklein aggregering og andre cellulære mekanismer som er involvert i progresjonen av Parkinsons sykdom. Artikkel III: Å belyse forholdet mellom mitokondrielle respiratoriske komplekser I og IV og tau-aggregering ved Alzheimers sykdom.
Metoder
Artikkel I: cellekultur (HeLa S3 og SH-SY5Y), rekombinant DNA-transfeksjon, konvensjonell immuncytokjemi og PARAPLAY, fluorescensmikroskopi. Artikkel II: cellekultur (SH-SY5Y, transgene SH-SY5Y-celler som uttrykker GFP-merket α-synuklein eller GFP alene), SDS-PAGE etterfulgt av immunoblotting, transfeksjon av α-synuklein forhåndsdannede fibriller, in vitro toksisitet og celle levedyktighetsanalyse, Seahorse mitostress-analyse. Artikkel III: firedobbel fluorescens immunhistokjemi og mikroskopi.
Resultater
Artikkel I: De Parkinsons sykdomsrelaterte proteinene DJ-1, LRRK2 og α-synuklein ble analysert. DJ-1 ble påvist i mitokondriematrisen, i tillegg til cytosolen, under normale forhold og stressforhold. Verken LRRK2 eller α-synuklein (villtype eller Parkinsons sykdom-relaterte varianter) ble funnet i mitokondriematrisen, under normale eller stressforhold. Artikkel II: Ved å bruke kloramfenikol behandling ble det etablert en kronisk, subletal mitokondriell translasjonshemmingsmodell. Mitokondrielle respiratoriske komplekse subenhetsproteinnivåer, mitokondriell respirasjon, proteinnedbrytningsveier og NAD+- avhengige acetyleringsveier ble alvorlig påvirket. Kronisk eksponering for kloramfenikol induserte også arter av α-synukleinprotein med høy molekylvekt. Artikkel III: Det finnes en assosiasjon mellom tau-patologi og høyere nivåer av mitokondrielt respiratorisk kompleks I og kompleks IV i CA1 hippocampus-regionen og entorhinal/trans-entorhinal cortex, i hjerneprøver fra individer med Alzheimers sykdom eller nevrologiske friske kontroller.
Konklusjoner
Artikkel I: Den suborganelle lokaliseringen av Parkinsons sykdom-relaterte proteiner, spesielt i mitokondriematrisen, er en utfordring og robuste metoder er nødvendige for å nøyaktig lokalisere disse proteinene. Med PARAPLAY-metoden ble fraværet av α- synuklein fra den mitokondriellen matriksen etablert, noe som tyder på at dets tidligere rapporterte interaksjoner med mitokondrielle respiratoriske kjedeproteiner ville finne sted i intermembranrommet. Artikkel II: Ved å bruke mitokondriell ribosomal hemming ble det etablert en modell for kronisk, subletal mitokondriell dysfunksjon, som kan brukes til å undersøke virkningen av mitokondriell respirasjonsmangel på ulike aspekter av sykdomsprosessen ved Parkinsons sykdom, spesielt unormal akkumulering av α-synuklein, noe som gjør det til en potensiell in vitro sykdomsmodell. Artikkel III: Nevronal tau-patologi er assosiert med høyere nivåer av respiratoriske komplekser I og IV i berørte nevroner, noe som reflekterer en kompenserende oppregulering av mitokondriell respirasjon og/eller mitokondriell biogenese, som respons på tau-mediert toksisitet. Background
Neurodegenerative disorders are complex disorders of the central nervous system that are typically characterized by the accumulation of misfolded proteins and progressive degeneration, and death of vulnerable cell populations in the affected brain regions. Mitochondrial dysfunction has been linked to the pathogenesis of several neurodegenerative disorders, including Parkinson’s disease and Alzheimer’s disease, and is a potential target for novel therapeutic approaches. However, the mechanisms underlying mitochondrial dysfunction and its association with the observed pathological processes in neurodegeneration remain unknown.
Aims
Paper I: To elucidate the subcellular and putative mitochondrial matrix localization of selected Parkinson’s disease-related proteins. Paper II: To establish an in vitro cell culture model of chronic, sublethal inhibition of mitochondrial protein translation, in order to analyze the effect of mitochondrial dysfunction on α-synuclein aggregation and other cellular mechanisms implicated in the progression of Parkinson’s disease. Paper III: To elucidate the relationship between the mitochondrial respiratory complexes I and IV and tau aggregation in Alzheimer’s disease.
Methods
Paper I: immortalized human cell cultures (HeLa S3 and SH-SY5Y), recombinant DNA transfection, conventional immunocytochemistry and PARAPLAY, fluorescence microscopy. Paper II: immortalized human cell cultures (SH-SY5Y, transgenic SH-SY5Y cells stably expressing GFP-tagged α-synuclein or GFP alone), SDS-PAGE followed by immunoblotting, transfection of α-synuclein preformed fibrils, in vitro toxicity and cell viability assay, Seahorse mitostress assay. Paper III: quadruple fluorescence immunohistochemistry and microscopy.
Results
Paper I: The Parkinson’s disease-related proteins DJ-1, LRRK2 and α-synuclein were analyzed. DJ-1 was detected in the mitochondrial matrix, in addition to the cytosol, under normal and stress conditions. Neither LRRK2 nor α-synuclein (wild-type or Parkinson’s disease-related variants) were found in the mitochondrial matrix, under normal or stress conditions. Paper II: Using chloramphenicol treatment, a chronic, sublethal mitochondrial translation inhibition model was established. Mitochondrial respiratory complex subunit protein levels, mitochondrial respiration, protein degradation pathways and NAD+- dependent acetylation pathways were severely affected. Chronic chloramphenicol exposure also induced high molecular weight species of α-synuclein protein. Paper III: There is an association between tau pathology and higher levels of mitochondrial respiratory complex I and complex IV in the CA1 hippocampal region and the entorhinal/trans-entorhinal cortex, in brain samples from individuals with Alzheimer’s disease or neurological healthy controls.
Conclusions
Paper I: The sub-organellar localization of Parkinson’s disease-related proteins, especially in the mitochondrial matrix, is a challenge and robust methods are needed to precisely localize these proteins. With the PARAPLAY method, the absence of α- synuclein from the mitochondrial matrix was established, suggesting that its previously reported interactions with mitochondrial respiratory chain proteins would take place in the intermembrane space. Paper II: Using mitochondrial ribosomal inhibition, a model for chronic, sublethal mitochondrial dysfunction was established, which can be applied to investigate the impact of mitochondrial respiratory deficiency on diverse aspects of the disease process in Parkinson’s disease, especially abnormal accumulation of α-synuclein, making it a potential in vitro disease model. Paper III: The presence of neuronal tau pathology is associated with higher levels of respiratory complexes I and IV in affected neurons, reflecting a compensatory upregulation of mitochondrial respiration and/or mitochondrial biogenesis, in response to tau-mediated toxicity.
Består av
Paper I. Nelson Osuagwu, Christian Dölle, Charalampos Tzoulis. Poly-ADP-ribose assisted protein localization resolves that DJ-1, but not LRRK2 or α-synuclein, is localized to the mitochondrial matrix. PLoS ONE. 2019, 14 (7), e0219909. The article is available at: https://hdl.handle.net/1956/21505.Paper II. Nelson Osuagwu, Christian Dölle, Charalampos Tzoulis. Long-term mitochondrial ribosomal inhibition induces alpha-synuclein aggregation and modulates Parkinson’s disease-associated pathways. Manuscript not available in BORA.
Paper III. Nelson Osuagwu, Irene Flønes, Christian Dölle, Charalampos Tzoulis. Tau pathology is associated with higher levels of mitochondrial respiratory complexes I and IV. Manuscript not available in BORA.