Studier av G-protein koblende reseptorer ved bruk av Fluorescens - teknikker

Abstract

Masteroppgaven tar for seg betydningen av den N-terminale halen på 5-HT2C og 5-HT2C-reseptorene, to forskjellige G-proteinkoblede reseptorer. Et spørsmål var om de har endogene signalpeptid, som prediktert i prediksjonsdatabasen SignalP 3.0. Det første prosjektet fokuserer på undersøkelser om 5-HT2C reseptoren har et endogent signalpeptid i sin N-terminalhale. Det finnes en polymorfisme som fører til en substitusjon av cystein med serin i posisjon 23 i den humane 5-HT2C reseptoren. Hos hvite er andelen som har en cystein i posisjon 23 87 %, mens 13 % har en serin. Det gjøres store epidemiologiske undersøkelser om dette har noen funksjonell konsekvens. Vi syntes at bakgrunnen for disse spekulasjoner var tynn. Dersom reseptoren har et 32 aminosyre langt klippbart signalpeptid vil Cys23Ser SNP være fraværende i det fungerende reseptorproteinet. I mitt andre prosjekt har vi undersøkt om den hydrofobe sekvensen i N-terminalhalen på a2C-reseptoren har en slik struktur fordi den skal vare en del av et fungerende signalpeptid, eller om denne uvanlig hydrofobe sekvens fyller en annen funksjon, som det i dag vites lite om. Konstrukt med FLAG epitop ble undersøkt ved bruk av fluorescensmikroskopi. Fluorescens- innmerking ble gjort ved bruk av to forskjellige primære antistoff (M1 og M2, pluss sekundært fluorescent antistoff). Antistoffet M2 merker in FLAG-epitopen uansett posisjon i proteinet. M1 merker in FLAG kun i absolutt N-posisjon, altså kun etter klipping foran FLAG-epitopen. Resultatene viste tydelig at det endogene antatte signalpeptidet i 5-HT2C-reseptoren fungerer som et klippbart SP. Det var også dette som ble prediktert i SignalP 3.0. Videre viste radioligandbinding at signalpeptidsekvensen ikke er nødvendig for uttrykk av 5-HT2C-reseptorerer i plasmamembranen da et trunkert konstrukt ble like bra uttrykt som villtypen. De samme forsøkene ble gjort med a2C-konstruktene. Disse viste at det predikterte endogene signalpeptidet i a2C-reseptoren ikke fungerte som et klippbart SP. Dette er stikk i strid med hva som ble prediktert for a2C-reseptoren i SignalP 3.0. Radioligandbindingforsøk med trunkerte a2C konstrukt viste at sekvensen imidlertid er viktig for reseptoruttrykk da en trunkert reseptor uttryktes 100 ganger lavere i membranen sammenlignet med villtypen.