Delineating cellular and molecular mechanisms of toxicity of an extract of khat (Catha edulis Forsk.) in leukemia and normal peripheral blood cells
Abstract
Plants have been used in treatment and prevention of diseases for thousands of years. In modern medicine there is a trend towards isolation and identification of bioactive molecules, whereas plant preparations continue to be used in traditional medicinal systems. However, combinations of drugs are usually administered in treatment of complex diseases like cancer and HIV, in order to target multiple deregulated cellular pathways simultaneously. Khat (Catha edulis Forsk.) has been cultivated for centuries primarily due to its use as a natural stimulant. The stimulating potential of khat is mainly caused by its content of cathinone, an alkaloid with structure and pharmacological profile similar to amphetamine. Cathinone is a labile precursor for the less bioactive derivatives cathine and norephedrine. An organic extract of khat was previously reported to induce programmed cell death in acute myeloid leukemia (AML) cell lines, while being less toxic to normal peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). In this study, cellular and molecular effects of an extract of khat were further elucidated in AML cell lines and compared with the cancer therapeutics camptothecin. Early effects of khat and the khat amphetamines on intracellular signaling responses in normal peripheral leukocytes were investigated, in addition to cytotoxic effects. The khat extract was fractionated and analysed for cytotoxicity in AML cell lines, and the fractions analysed by mass spectrometry. The khat extract was shown to induce cell death in a subset of genetically diverse AML cell lines, indicating involvement of specific mechanisms. In contrast to camptothecin, khat caused structural damage to mitochondria and mediated impaired mitochondrial respiration. In addition, khat was observed to induce formation of autophagosomes, indicating activation of autophagy. The survival protein Bcl-2 protected against camptothecin, and partial protection was obtained against khat-induced cell death. Procaspase-8 of the receptormediated cell death pathway was activated by khat, while levels of the death antagonists Mcl-1 and c-FLIPL were reduced. The stress sensor and tumour suppressor protein p53 was induced and modulated in khat-mediated death, but not by sub-lethal dilutions of the khat extract or in khat-resistant cells. Experiments using p53 knock-down and knock-out cells demonstrated that khat-mediated cell death was independent of p53. The p53 protein was suggested to primarily act as a stress sensor in AML cells that were susceptible to khatinduced cell death. Fractionation of the khat extract and bio-guided screening in AML cell lines resulted in identification of three separate cytotoxic fractions. The khat fractions were analysed by mass spectrometry, which led to the partial characterization of a phenylpropanoid glycoside suggested to represent the major cytotoxic constituent in the khat extract. In contrast to khat, the khat amphetamines were observed to be relatively non-toxic to AML cell lines. Khat and the khat amphetamines were shown to mediate early and generally opposite effects on signaling mediators in normal immune cells. Whereas khat activated stress sensors, like p38 and p53, and demonstrated cytotoxic effects, the khat amphetamines attenuated activating modifications of several signaling proteins, including p53, and appeared to have a stimulating effect on lymphocyte proliferation. Planter har blitt brukt i behandling og forebygging av sykdom i tusener av år. I moderne medisin er det vanlig å isolere og identifisere bioaktive substanser, mens plantepreparater fortsatt blir brukt i tradisjonelle medisinske systemer. Kombinasjoner av ulike typer medisin er likevel vanlig ved behandling av sykdommer som kreft og HIV, med den hensikt å ramme flere av de deregulerte cellulære signalveiene som forårsaker sykdom. Khat (Catha edulis Forsk.) har blitt dyrket i århundrer, først og fremst for å bli benyttet som en naturlig stimulant. Den stimulerende effekten skyldes primært khat plantens innhold av katinon, et alkaloid som har lignende struktur og farmakologisk profil som amfetamin. Katinon er en labil forbindelse som blir omdannet til de mindre stimulerende derivatene katin og norefedrin. Et organisk ekstrakt av khat ble tidligere vist å aktivere programmert celledød i akutt myelogen leukemi (AML) cellelinjer, mens det var mindre toksisk for normale perifere blod mononukleære celler (PBMC). I denne studien ble de cellulære og molekylære effektene av et khat ekstrakt videre undersøkt i AML cellelinjer, og sammenlignet med kreftmedisinen camptothecin. Tidlige effekter av khat og khat amfetaminene på intracellulære signaleringsproteiner ble undersøkt i normale leukocytter, i tillegg til cytotoksiske effekter. Khat ekstraktet ble fraksjonert og undersøkt for cytotoksiske effekter i AML cellelinjer, og fraksjonene ble analysert med massespektrometri. Khat ekstraktet ble vist å indusere celledød i et utvalg av genetisk ulike AML cellelinjer, noe som indikerte aktivering av spesifikke mekanismer. I motsetning til camptothecin førte khat behandling til strukturell skade i mitokondriene, noe som hemmet den mitokondrielle respirasjonen. Videre ble det observert at khat induserte dannelse av autofagosomer, noe som indikerte aktivering av autofagi. Overlevelsesproteinet Bcl-2 beskyttet mot camptothecin, men ga bare delvis beskyttelse mot khat-indusert celledød. Procaspase-8, som er del av den reseptormedierte celledødsveien, ble aktivert av khat, mens nivåene av dødsantagonistene Mcl-1 og c-FLIPL ble redusert. Stress sensor og tumor suppressor proteinet p53 ble indusert og modulert i khat-mediert død, med ikke av ikke-dødelige khat doser eller i khat-resistente celler. Eksperimenter med p53 knock-out og knock-down celler viste at p53 ikke var nødvendig i khat-mediert celledød. p53 proteinet ble foreslått å fungere primært som en stress sensor i AML celler som var sensitive for khat. Fraksjonering av khat ekstraktet og testing av fraksjonene for toksisitet i AML cellelinjer, resulterte i identifisering av tre separate cytotoksiske fraksjoner. Khat fraksjonene ble analysert med massespektrometri, og et fenylpropanoid glykosid ble delvis karakterisert og foreslått å være den mest toksiske komponenten i khat ekstraktet. In motsetning til khat ble khat amfetaminene vist å være relativt ikke-toksiske i khat-sensitive AML celler. Khat og khat amfetaminene ble vist å gi hurtige og generelt motsatte effekter på ulike signaleringsproteiner i normale immun celler. Mens khat aktiverte stress proteiner, som p38 og p53, og induserte cytotoksiske effekter, resulterte khat amfetaminene i reduserte nivåer av aktiverende modifikasjoner hos flere signalproteiner, inkludert p53, og ble vist å ha en stimulerende effekt på lymfocytt proliferasjon.
Has parts
Paper I: Molecular Cancer 8(101), Bredholt, T.; Dimba, E. A. O.; Hagland, H. R.; Wergeland, L.; Skavland, J.; Fossan, K. O.; Tronstad, K. J.; Johannessen, A. C.; Vintermyr, O. K.; Gjertsen, B. T., Camptothecin and khat (Catha edulis Forsk.) induced distinct cell death phenotypes involving modulation of c-FLIPL, Mcl-1, procaspase-8 and mitochondrial function in acute myeloid leukemia cell lines. Copyright 2009 Bredholt et al; licensee BioMed Central. Reproduced with permission. Published version. The published version is also available at: http://dx.doi.org/10.1186/1476-4598-8-101Paper II: Bredholt, T.; Hjelle, S. M.; Haaland, I.; Wergeland, L.; Huseby, S.; Vintermyr, O. K.; Johannessen, A. C.; Gjertsen, B. T., 2010, Modulation of p53 isoforms and its post-translational modifications reflect the cytotoxicity of a botanical khat extract. Full text not available in BORA.
Paper III: Bredholt, T.; Ersvær, E.; Erikstein, B. S.; Fossan, K. O.; Johannessen, A. C.; Vintermyr, O. K.; Bruserud, Ø.; Gjertsen, B. T., 2010, Natural khatderived amphetamines attenuate phosphorylation of AKT, STAT6, CREB and p53 in peripheral leukocytes. Full text not available in BORA.
Paper IV: Bredholt, T.; Herfindal, L.; Marston, A.; Johannessen, A. C.; Gjertsen, B. T.; Vintermyr, O. K., Bio-guided isolation of a major cytotoxic constituent in khat (Catha edulis Forsk.) unrelated to natural khat amphetamines. Full text not available in BORA.
Publisher
The University of BergenCopyright
Copyright the author. All rights reservedThe author