Understanding proteostasis dysregulation in phenylketonuria – a paradigm disease for inborn error of metabolism

Abstract

Fenylketonuria (PKU) er en medfødt stoffskiftesykdom forårsaket av mutasjoner i genet for fenylalanin hydroksylase (PAH), og fører til ustabile og ofte feilfoldete enzymer med nedsatt evne til å metabolisere aminosyren fenylalanin (Phe). Den påfølgende opphopningen av Phe i blodet (hyperfenylalaninemi, HPA) kan nå nevrotoksiske nivåer, og uten behandling vil dette føre til alvorlige fysiske og psykiske funksjonshemninger, epilepsi og adferdsproblemer. Pasienter behandles derfor med en streng lav-Phe diett fra fødsel og anbefales å forbli på dietten livet ut. Den fenotypiske variasjonen er høy, da de fleste pasientene er heterozygoter, og mer enn 1200 PKU mutasjoner er registrert. Flere musemodeller for PKU (Enu1, Enu2 og Enu3) har vært tilgjengelige for PKU-forskning, og i dette arbeidet presenteres en ny musemodell som representerer en mutasjon med høy utbredelse i pasienter, Pah-R261Q.

Det komplekse proteostase-nettverket omfatter translasjonsmaskineriet, molekylære chaperoner og cochaperoner, ubiquitin-proteasom systemet (UPS) og autofagimaskineriet. Proteostase-nettverket bistår og kontrollerer dannelsen, foldingen og nivåene av native proteiner, og er spesielt involvert i å motvirke akkumuleringen av feilfoldete og aggregerte proteiner. Mutert PAH har tidligere vist seg å danne små aggregater som er antatt å bli nedbrutt av UPS, men mye er fortsatt uvisst når det kommer til proteostase-reguleringen og nedbrytningsmekanismene for PAH og dets mutanter i pasienter. DNAJC12, en molekylær cochaperon i HSP40 familien, har nylig blitt identifisert som en spesifikk cochaperon for de tetrahydrobiopterin (BH4)-avhengige aromatiske aminosyre-hydroksylasene, proteinfamilien PAH tilhører, og er viktig for deres korrekte folding og vedlikehold. Vi studerte rollen DNAJC12 har i folding og nedbrytning av villtype (WT) og mutert PAH, både in vitro og in vivo. Våre resultater viste lavere nivåer av PAH og DNAJC12 i cellene som uttrykte PAH-mutanter, samt i Enu1 mus (homozygote for Pah varianten V106A) sammenlignet med WT mus. Mesteparten av det muterte PAH, men ikke WT-PAH, viste seg å være mono-ubiquitinert i leverlysater fra mus. I tillegg viste eksperimenter med co-immunopresipitering i leverlysater komplekse formasjoner mellom DNAJC12 og PAH (både WT og ubiquitinert mutant), og våre resultater underbygger at cochaperonen spiller en rolle både i folding av PAH og i prosesseringen av dens misfoldede ubiquitinerte former.

Vi genererte og karakteriserte Pah-R261Q musemodellen som viste BH4-responderende HPA. Det muterte PAH var feilfoldet og presenterte amyloid aggregering i lever, assosiert med en toksisk "gain-of-function". Denne typen aggregering har ikke tidligere vært vist for HPA eller PKU mutasjoner, og ser ut til å assosieres med deregulering av proteostase, endret lipid metabolisme og oksidativt stress. Sammenlignet med Enu1 og WT, som viser lignende mRNA-nivåer av DNAJC12, hadde Pah-R261Q en oppregulering av cochaperonen, som er en videre bekreftelse av oksidativt stress i denne musen. Til forskjell fra de mindre PAH aggregatene i Enu1, ser de ubiquitinerte amyloid-lignende PAH-aggregatene ut til å være for store for nedbrytning av UPS, og aktiveringen av autofagisystemet ble indikert ved kolokaliseringen av muterte PAH aggregater og markører for autofagi. Mens PKU tradisjonelt har vært ansett som en "loss-of-function" sykdom har vårt arbeid vist at noen mutasjoner kan vise en toksisk "gain-of-function" grunnet store PAH aggregater, som muligens fører til oksidativt stress og ytterligere tilleggssykdommer.

Aldring har blitt påvist å føre til nedgang i proteostasenettverkets effektivitet, forstyrrelser i den proteomiske balansen og økt oksidativt stress, i tillegg til forverring av alders-relaterte sykdommer. Vi forventet derfor at Pah-R261Q musene, med deres store PAH aggregater i lever og økt oksidativt stress, skulle ha en redusert generell helsestatus, økte tilleggssykdommer og muligens tidlig død når de ble gamle. Den aldrende Pah-R261Q musen hadde en økt serum-konsentrasjon av Phe sammenlignet med både WT og unge Pah-R261Q, men viste ingen tegn på nevrologiske problemer. Flere av biomarkør-konsentrasjonene som indikerte oksidativt stress i de unge Pah-R261Q musene viste en uventet normalisering mot WT nivåer i de gamle musene. Selv om biomarkør-konsentrasjonene var like i gamle Pah-R261Q og WT mus så viste interrelasjons-plot mellom par av biomarkører en distinkt forskjell, som kan indikere at en annen underliggende metabolsk mekanisme kan påvirke de muterte musene. Den lille forbedringen i motorfunksjon og forebyggingen av tidlig død og tilleggssykdommer kan muligens forklares med den sterke aktiveringen av autofagi fra tidlig alder i den muterte musen.

For å konkludere har dette arbeidet avdekket ny kunnskap om aggregeringen og nedbrytningen av mutert PAH; involvering av DNAJC12, visualisering av små PAH aggregater i lever fra Enu1 mus, store amyloid-lignende aggregater i lever fra Pah-R261Q mus og aktivering av autofagi for å bryte ned de store aggregatene. I Pah-R261Q musen fant vi en uventet toksisk "gain-of-function" grunnet feilfoldet PAH. PKU har vært en modellsykdom for mange medfødte stoffskiftesykdommer, og våre funn forventes å bidra til bedre mekanistisk forståelse av fenotypiske variasjon i flere av disse arvelige sykdommene.

Phenylketonuria (PKU) is an inborn error of metabolism caused by mutations in the phenylalanine hydroxylase (PAH) gene, resulting in unstable and often misfolded enzyme with reduced ability to metabolize the amino acid phenylalanine (Phe). The subsequent buildup of blood Phe (hyperphenylalaninemia, HPA) can reach neurotoxic levels, and if left untreated it will result in severe intellectual disability, motor deficits, epilepsy, and behavioral problems. Patients are therefore treated with a strict low-Phe diet from birth and are advised to stay on the diet throughout their life. The phenotypic variability is high, as most patients are heterozygotes, and more than 1200 PKU mutations are registered. Several mouse models for PKU (Enu1, Enu2 and Enu3) have been available for PKU investigations, and in this work we present a novel mouse model representing a mutation with high prevalence in patients, Pah-R261Q.

The complex proteostasis network, including the translational machinery, molecular chaperones and cochaperones, the ubiquitin-proteasome system (UPS), and the autophagy machinery, manages and controls the folding and levels of native proteins, and it is especially involved in counteracting the accumulation of misfolded and aggregated proteins. Mutated PAH has previously been shown to form small aggregates that are presumed to be degraded by the UPS, but much is unknown about the proteostasis regulation and the degradation mechanisms of PAH and its mutants in patients. Recently, DNAJC12, a molecular cochaperone of the HSP40 family, has been identified as the specific cochaperone of the tetrahydrobiopterin (BH4) dependent aromatic amino acid hydroxylases, the protein family to which PAH belongs, and is important for their correct folding and maintenance. We studied the role of DNAJC12 in the folding and degradation of wild-type (WT) and mutant PAH, both in vitro and in vivo. Our results showed lower levels of PAH and DNAJC12 in cells expressing PAH mutants, as well as in Enu1 mice (homozygous for the Pah variant V106A) compared to WT mice. Most mutant PAH, but not WT-PAH, appeared mono-ubiquitinated in mouse liver lysates. Moreover, by co-immunoprecipitation experiments in liver lysates we probed the complex formation between DNAJC12 and PAH (both WT and ubiquitinated mutant), and our results support that the cochaperone plays a role both in the folding of PAH and in the processing of its misfolded ubiquitinated conformations.

Further, we generated and characterized the Pah-R261Q mouse model, which presented BH4 responsive HPA. The mutant PAH was misfolded and displayed amyloid aggregation in liver, associated with toxic gain-of-function. This type of aggregation has so far been unknown for HPA or PKU mutations, where it appears associated with proteostasis dysregulation, altered lipid metabolism, and oxidative stress. Compared with Enu1 and WT, which show comparable mRNA expression of DNAJC12, Pah- R261Q presented an upregulation of the cochaperone, further confirming the oxidative stress in this mouse. Differently to the smaller PAH aggregates in Enu1, the ubiquitinated amyloid-like PAH aggregates appear too large for the UPS, and engagement of the autophagy system was indicated by colocalization of mutant PAH aggregates and autophagy markers. Whereas PKU has traditionally been considered a loss-of-function disorder, our work shows that some mutations may display a toxic gainof- function due to large PAH aggregates, possibly leading to oxidative stress and additional comorbidities.

Aging has been shown to lead to a decline in proteostasis network efficiency, disturbance of the proteomic balance and increased oxidative stress, as well as a worsening of age-related diseases. We therefore expected that the Pah-R261Q mice, with their large PAH aggregates in liver and increased oxidative stress, would exhibit a reduced general health, increased comorbidities, and possibly early death when reaching old age. The aging Pah-R261Q mice did present an increased serum concentration of Phe compared to both old WT and young Pah-R261Q mice but did not show signs of neurological issues. Unexpectedly, several of the biomarker concentrations indicating oxidative stress in the young Pah-R261Q mice seemed to have normalized towards WT levels in the old mice. Although the biomarker concentrations were similar in old Pah- R261Q and WT mice, interrelation plots between pairs of biomarkers revealed distinct differences, suggesting that different underlying metabolic mechanisms may be at work in the mutant mice. The slightly improved motor function and prevention of premature death and comorbidities may be explained by the strong activation of autophagy in the mutant mice from a young age.

To conclude, this work has revealed new knowledge about the aggregation and degradation of mutant PAH with the involvement of DNAJC12, visualization of small PAH aggregates in Enu1 mouse livers, large amyloid-like aggregates in Pah-R261Q mouse livers, and engagement of autophagy to degrade the large aggregates. In Pah- R261Q mice we found the unexpected toxic gain-of-function of PAH misfolding. As PKU has been a model disease for many inborn errors of metabolism, the present findings are expected to contribute to a better mechanistic understanding of the phenotypic variability in these genetic disorders.