Structure-based Druggability Predictions of RNA Binding Sites and Design of RNA Ligands

Abstract

Den post-antibotiske æraen truer og for å møte denne krisen trengs det tilgang til nye klasser av antibiotika. Ribvoswitcher er cis-genregulerende foldete strukturer av ikke-kodende RNA, som handler gjennom konformasjonsendringer indusert av binding til mindre molekyler. Siden disse riboswitchene har blitt identifisert som nøkkelkomponenter i bakteriell biologi, og er essensielt utelukket i mammalske celler, er de lovende mål for nye klasser av antibiotika

I denne oppgaven har vi utforsket riboswitcher som lovende legemiddelmål. Et legemiddelmål må være relevant for en gitt sykdom og må også kunne være regularbar gjennom enten biologiske molekyler eller mindre molekyler. I det siste tilfellet, må legemiddemålet kunne binde seg til små legemiddelaktige molekyler med høy affinitet, og slik binding blir referert som "druggable" (norsk: dopbar). Tidligere i Brenk-gruppen har en prediktor (DrugPred) blitt utviklet for å identifisere slike bindingsseter i proteiner. Som et av målene i denne avhandlingen, har denne prediktoren blitt utvidet til å være kompatibel med bindigsseter i RNA. Grunnet mangelen på validerte dopbare RNA bindingsseter, er den nye prediktoren, DrugPred_RNA, trent på protein bindingsseter med deskriptorer som gjelder for bindingsseter både i RNA og proteinstrukturer. Denne versjonen kunne både predikere med høy treffsikkehet og presisjon, og hadde resultater sammenlignbare med den siste versjonen av DrugPred. Etter at den nye prediktoren ble brukt på en større samling av ligand-inneholdende RNA krystallstrukturer funnet i Protein Data Bank, evaluerte vi resultatene fra DrugPred_RNA og fant at de dopbare RNA bindingssetene var riktig klassifisert av programvaren. Prediksjonene fra DrugPred_RNA var også funnet til å være høyt robuste og gjennom det hele ble bindingsseter som var lignende i konformasjon og bindingssetekomposisjon gitt like prediksjoner. Det ble også funnet at konformasjonsendringer kunne gi alvorlige utslag på utfallet av prediksjonen. Blant de funne dopbare RNA-bindingssetene, var mange riboswitcher funnet, noe som understreker denne klassen av makromolekyler som potensielle mål for nye antibiotika. Mange av de dopbare strukturene var også funnet til å være ribosomale bindingsseter, som kan være med på å dirigere utviklingen av nye antibiotika. Alt i alt, ble DrugPred_RNA funnet til å være et nyttig verktøy for prediksjonen av dopbare RNA bindingsseter.

Blant riboswitchene som ble funnet til å være dopbare bar FMN riboswitchen. Denne riboswitchen regulerer uttrykking av gener involvert i biosyntese av riboflavin og binder til flavin mononukleotid (FMN). FMN riboswitchen hører til en av de mest studerte kalssene av riboswitcher og flere potente bindere har blitt identifisert. Det har også blitt vist at disse binderne greier å inhibere bakterievekst, og dette tatt i betraktning sammen med høy tilstedeværelse i menneskelige patogener, som inkluderer varianter beslektet med nosokomiale infeksjoner, gjør det til et av de mest relevante målene å forfølge. Gjennom strukturell bioinformatikk, har vi designet stoffer in silico, og predikert deres bindingsmoduser. Drivkreftene til designen av disse kandidatene var å skape syntetisk tilgjengelige molekyler som ivaretar nøkkelinteraksjoner observert eller postulert mellom bindingssetet i FMN riboswitchen og FMN, ribocil (et stoff oppdaget av Merck) samt RSL-0035 (et stoff opdaget i tidligere arbeid i Brenklaben), mens samtidig utforske nye interaksjoner.

The threat of the post-antibiotic era is looming and addressing this crisis requires access to new classes of antibiotics. Riboswitches are cis-gene regulating folded structures of non-coding RNA, which act through conformational changes induced after binding to small molecules. As riboswitches have been identified as a key component in bacterial biology and are essentially absent in mammalian cells, they constitute promising targets for novel classes of antibiotics

Herein, we have explored the possibility of addressing riboswitches as potential drug targets. A drug target needs to be relevant for a given disease and needs to be mofiable by either biological molecules or small molecules. In the latter case, the drug target needs to be able to bind small drug-like molecules with high affinity. Such binding sites are referred to as “druggable”. Previously in the Brenk group, a predictor (DrugPred) was developed to identify such binding sites in proteins. As part of this thesis, this predictor has been extended to be compatible with RNA binding sites. Due to the paucity of validated druggable RNA binding sites, the predictor, DrugPred_RNA, was trained on protein binding sites with descriptors that are applicable for both protein and RNA binding sites. It was found that this version was able to make predictions with high accuracy and precision, which were comparable to the last iteration of DrugPred. After applying this predictor on a large swathe of ligand-containing RNA crystal structures deposited in the Protein Data Bank, we have evaluated the predictions of DrugPred_RNA and found that known druggable RNA binding sites were classified correctly. The predictions of DrugPred_RNA were also found to be highly robust, and overall, binding sites which were found to be both similar in conformation and binding site composition were given the same prediction. However, it was also found that conformational changes could severely affect the outcomes. Further amon the RNA binding sites predicted to be druggable, many riboswitches were found, underlining this class of macromolecules as a potential target for new antibiotics. Many of the druggable structures were also ribosomal binding sites, which could also guide the development of new antibiotics. Overall, DrugPred_RNA was found to be a useful tool for the prediction of druggable RNA binding sites

Among the riboswitches which were found to be druggable was the FMN riboswitch. This riboswitch regulates the expression of genes involved in biosynthesis of riboflavin and binds to flavin mononucleotide (FMN). The FMN riboswitch belongs to one of the most studied classes of riboswitches, and several potent binders have been identified. It has also been shown that these binders are able to inhibit growth of bacteria, and this, combined with its prevalence in human pathogens, including strains associated with nosocomial infections, makes it one of the most relevant targets to pursue. Using structural bioinformatics, we have designed compounds in silico and predicted their binding modes. The driving forces of the design of these candidates were to create synthetically feasible compounds which retain what we believe are key interactions observed or postulated between the FMN riboswitch binding site and FMN, ribocil A (a compound discovered by Merck) as well as for RSL-0035 (a compound discovered in previous work within the Brenk lab), while simultaneously exploring new interactions.