Monoamine synthesis in neurometabolic disorders affecting catecholaminergic functioning: biochemical mechanisms and treatment implications

Abstract

Løpet av de siste 100 år er det oppdaget hundrevis av arvelige metabolske forstyrrelser. Slike tilstander har ofte recessiv Mendelsk arv og kalles også medfødte metabolismefeil. Symptomene debuterer vanligvis like etter fødselen eller senere i ungdomsårene og er ofte progressive, noe som kan resultere i tidlig død eller alvorlige, livslange problemer. Selv om de fleste av disse tilstandene er sjeldne, bidrar de samlet til store samfunnsutgifter, funksjonshemming og menneskelig lidelse. Hvis de oppdages tidlig, kan likevel mange av tilstandene behandles, og mange pasienter kan oppnå normale eller nesten normale utviklingsmilepæler. Denne PhD-avhandlingen utforsker molekylære mekanismer som finnes i tre forskjellige sykdommer som påvirker metabolismen av de aromatiske aminosyrene fenylalanin og tyrosin. Den første artikkelen beskriver egenskapene til human tyrosinhydroksylase (TH). Dette enzymet katalyserer det hastighetsbegrensende trinnet i syntesen av katekolaminnevrotransmittere. Noen kodende varianter av TH («missensevarianter») har vært assosiert med svært lave nivåer av dopamin og noradrenalin i hjernen, noe som resulterer i de nevrologiske sykdommene DOPA-responsiv dystoni (DRD) eller progressiv encefalopati. Vi produserte og renset human TH fra bakterien E. coli og studerte villtype-enzymet, samt tre forskjellige sykdomsassosierte missense-varianter i enzymets regulatoriske, katalytiske eller oligomeriseringsdomener. De DRD-assosierte variantene R410P og D467G endret enzymets naturlige tetramere tilstand, noe som resulterte i dimerer med lav gjenværende aktivitet. E114K-varianten viste konformasjonsendringer i det regulatoriske domenet, men den katalytiske aktiviteten var intakt. Denne enzymvarianten hadde lavt ekspresjonsnivå og muligens endrede regulatoriske egenskaper. I den andre artikkelen sammenlignet vi konsentrasjonen av tyrosin i plasma og kognitiv ytelse hos norske barn med sykdommen tyrosinemi type 1 (TYRSN1). Dette er en sjelden metabolsk sykdom som skyldes mangel på enzymet fumarylacetoacetathydrolase, et enzym som er nødvendig for nedbrytning av tyrosin. Vi fant en signifikant positiv korrelasjon mellom pasientenes gjennomsnittlige nivåer av tyrosin i blodet og symptomer på uoppmerksomhet. Dette kan skyldes at høye konsentrasjoner av tyrosin gir en nedsatt produksjon av nevrotransmitterne dopamin og serotonin. Denne hypotesen ble støttet av studier som viste nedsatt aktivitet av enzymene TH og tryptofanhydroksylase in vitro ved tilsvarende høye nivåer av tyrosin. Det er mulig at hemming av disse enzymene ved nitisinon (NTBC)-behandlet TYRSN1 kan gi nedsatt biosyntese av monoaminer i hjernen, og at de kognitive problemene kan være relatert til disse endringene. Denne hypotesen ble videre utforsket i den tredje artikkelen, der vi undersøkte det molekylære grunnlaget for nedsatt dopaminproduksjon og mulige felles patofysiologiske mekanismer i TYRSN1 og fenylketonuri. Rottefeokromocytomceller (PC12) ble eksponert for cellekulturmedier med forskjellige konsentrasjoner av enten fenylalanin eller tyrosin. Høye ekstracellulære nivåer av fenylalanin tømte raskt cellene for tyrosin og dopamin. Tilsvarende ble reduserte dopaminnivåer observert i nærvær av både lave og svært høye nivåer av tyrosin. Dette ble ledsaget av endrede nivåer av mange cellulære proteiner, inkludert TH. Basert på disse funnene, laget vi en matematisk modell for omsetning av aromatiske aminosyrer og monoaminbiosyntesen ved forskjellige substratnivåer. Disse resultatene kan bidra til en økt mekanistisk forståelse av den normale regulering av monoaminsyntesen og hvordan denne endres ved nevrometabolske sykdommer.

During the past century, hundreds of different inherited metabolic disorders have been discovered. Such conditions typically show a pattern of recessive Mendelian inheritance and are also termed inborn errors of metabolism. Symptoms typically appear perinatally or later during adolescence and are often progressive, resulting in either early mortality or severe, life-long impairments. Although most of these conditions are rare, collectively, they contribute to large societal expenses, disability and human suffering. Crucially, if recognized early, many of the conditions can be treated, achieving normal or almost normal neurodevelopmental milestones for many affected individuals. This dissertation explores molecular mechanisms present in three different diseases affecting the metabolism of the aromatic amino acids phenylalanine and tyrosine. The first article describes the properties of human tyrosine hydroxylase (TH). This enzyme catalyzes the rate-limiting step in the synthesis of catecholamine (CA) neurotransmitters. Missense variants of TH have been associated with low levels of brain dopamine and noradrenaline, resulting in DOPA-responsive dystonia (DRD) or progressive brain encephalopathy. We produced and purified human TH from E. coli and studied the wild-type (WT) enzyme, as well as three different disease-associated coding variants in the enzyme’s regulatory, catalytic or oligomerization domains. The DRD-associated variants R410P and D467G caused a disruption of the enzyme's native tetrameric state, resulting in transient, low residual activity dimers. The E114K variant showed conformational changes within the regulatory domain while the catalytic activity was intact. This enzyme variant had low expression levels and possibly altered regulatory properties. In the second article we measured plasma tyrosine levels and cognitive performance in Norwegian children with tyrosinemia type 1 (TYRSN1). This is a rare metabolic disease characterized by lack of fumarylacetoacetate hydrolase, which is necessary for tyrosine catabolism. We observed a significant positive correlation between mean concentrations of tyrosine in blood plasma and symptoms of inattention. This relationship may be partially due to a reduced production of the neurotransmitters dopamine and serotonin in the presence of high concentrations of tyrosine. This hypothesis was supported by studies that showed reduced activity of the enzymes TH and tryptophan hydroxylase in vitro at correspondingly high levels of tyrosine. It is possible that inhibition of these enzymes in nitisinone (NTBC) treated TYRSN1 may result in reduced biosynthesis of monoamines in the brain, and that cognitive problems may be related to this reduction. This hypothesis was further explored in Article III, where we investigated the molecular basis of impaired dopamine production and possible shared pathophysiological mechanisms in TYRSN1 and phenylketonuria. Rat pheochromocytoma (PC12) cells were exposed to cell culture media with different concentrations of either phenylalanine or tyrosine. High extracellular levels of phenylalanine rapidly depleted the cells of tyrosine and dopamine. Similarly, reduced dopamine levels were observed in the presence of either low or very high levels of tyrosine. This was accompanied by altered levels of many cellular proteins, including TH. Based on these findings, we built a quantitative model for turnover of aromatic amino acids and monoamine biosynthesis at different substrate levels. These results may contribute to a deeper mechanistic understanding of the normal regulation of monoamine synthesis and how this is altered in neurometabolic diseases.