Raising and characterization of polyclonal antibodies against the arginine transporter AAP3 from Leishmania donovani
Master thesis
![Thumbnail](/bora-xmlui/bitstream/handle/1956/13005/144908379.pdf.jpg?sequence=3&isAllowed=y)
Åpne
Permanent lenke
https://hdl.handle.net/1956/13005Utgivelsesdato
2016-06-06Metadata
Vis full innførselSamlinger
Sammendrag
Leishmania is an intracellular protozoa causing the tropical disease leishmaniasis. The disease is spread by female sandflies from the Phlebotomus and the Lutzomyia genera, and can cause diverse manifestations ranging from asymptomatic disease to lethal visceral leishmaniasis. The amino acid permease (AAP) transporter is conserved in the different Leishmania species, and is important for Leishmania survival and virulence. This makes the investigation on this protein important for development of new drug and vaccines. The aim of this study was to successfully express and purify the LdAAP3 (Leishmania donovani amino acid permease 3) transporter protein in E. coli and use this recombinant antigen to produce polyclonal antibodies in rabbit. The LdAAP3 gene was cloned into a pET TOPO vector, for expression of recombinant protein in E. coli, and purified by affinity chromatography as His-tags were attached to the N-terminal (Nter) end of the target protein. The purified recombinant protein was quantified and injected in rabbits to raise polyclonal antibodies. Sera obtained from the injected rabbits were tested for their binding affinity to recombinant LdAAP3 protein or lysated Leishmania amazonensis by using Western blots and ELISA. The results from the expression were analyzed on different SDS- PAGE and Western blots, and revealed a successful expression of the LdAAP3 protein. Comparing the binding of antibodies from pre- immunized and immunized sera to LdAAP3 recombinant protein revealed a successful production of anti-LdAAP3 antibodies. ELISA experiments confirm that anti-LdAAP3 antibodies have binding affinity to epitopes of Leishmania amazonensis. Throughout the experiments a binding pattern was obtained by the observation of repeated protein bands often found at sizes around 56 kDa, 45 kDa, 38 kDa, 32 kDa, 26 kDa and 12 kDa on SDS-PAGE and Western blots incubated with sera from infected subjects. In conclusion, the successful production of the LdAAP3 recombinant protein, lead to the production of polyclonal anti-LdAAP3 antibodies, which could be used for future localization of the AAP3 protein in Leishmania cells by imaging techniques such as confocal or electron microscopy. The LdAAP3 recombinant proteins also enabled detection of antibodies from infected subjects by binding to the epitopes on the recombinant protein. This gave a binding pattern that was characteristic for infected subjects. To be able to use this method for further diagnostics, experiments will have to be done comparing the binding specificity and avidity, and testing the similarities of similar genus like Crithidia and Leptomonas, which also produce AAP transporters. Leishmania er en intracellulær protozo som fører til sykdommen leishmaniasis. Sykdommen spres med sandfluer av typen Phlebotomus og Lutzomyia. Den kan føre til ulike manifestasjoner fra asymptomatisk til dødelig visceral sykdom. Aminosyrepermeasene (AAP) er konservert i de ulike Leishmania- stammene, og er viktig for Leishmania sin overlevelse og virulens. Derfor har dette proteinet potensialle for utvikling av nye medisiner og vaksiner. Målet til denne studien var å uttryke og rense LdAAP3 (Leishmania donovani amino acid permease 3) transporter proteinet i E.coli, og bruke dette rekombinante proteinet til å produsere polyklonale antistoffer i kaniner. LdAAP3 genet ble klonet i pET TOPO vektoren for ekspresjon av recombinant protein i E.coli, og renset ved hjelp av affinitets kromatografi siden proteinet inneholdt polyhistidine-tags. Det rensede rekombinante proteinet ble kvantifisert og kaniner ble immuniset med proteinet for å lage polyklonale antistoffer. Ved hjelp av Western blot og ELISA ble sera fra de inokulerte kaninene undersøkt for sin binding til det rekombinante LdAAP3 proteinet eller lysert Leishmania amazonensis. Resultatene fra ekspresjonen ble analysert ved SDS-PAGE og Western blot. LdAAP3 proteinet ble uttrykt og renset. ELISA og Western blot analyser viste at antistoffer hadde blitt produsert når man sammenlignet serum fra før og etter immunisering i kaninene. ELISA eksperimenter bekreftet at anti-LdAAP3 antistoffer har bindingsaffinitet til epitoper på Leishmania amazonensis. Når Western blot ble inkubert med sera fra personer med leishmaniasis fant man proteinbånd ved rundt 56 kDa, 45 kDa, 38 kDa, 26 kDa og 12 kDa. For å konkludere, det rekombinante proteinet LdAAP3 ble produsert og ble brukt til å produsere polyklonale LdAAP3 antistoffer i kaniner. Antistoffer kan potensielt brukes til lokalisering av AAP3- proteinet i Leishmania parasitten. LdAAP3 proteinet ble også brukt til detektering av antistoffer hos personer med leishmaniainfeksjonen. For at metoden skal kunne brukes i diagnostikk vil eksperimenter måtte bli utført for å undersøke spesifisitet, sensitivitet og vurdere kryssreaktivitet til andre mikrober som Crithidia og Leptomonas, som også produserer AAP transportører.